实验二(研究生分生)

1、实验二 总RNA提取、RT-PCR制备cDNA及DNA克隆Total RNA Preparation,cDNA preparation by RT-PCR,and DNA cloning1实验二和实验三是以获取纯化的表达蛋白质为目的，从RNA提取开始，经过RT-PCR获取特定基因的cDNA片断，再进行重组、筛选获取克隆，最后进行基因编码蛋白质的表达、纯化、和检测。2第一天1.小鼠脑总RNA的提取；2. RNA含量测定；3. RT-PCR4.载体酶切3第二天1.琼脂糖凝胶电泳检测检查RNA及PCR产物；2. RT-PCR产物的纯化；3. PCR产物的快速酶切；4.载体及PCR酶切产物的乙醇沉淀纯

2、化；5.琼脂糖凝胶电泳检测检查载体及PCR酶切状况，DNA浓度的微量测定；6.连接反应4第三天1.感受态细菌的制备；2.细菌转化5从组织中一步法分离总RNATotal RNA isolation from tissues by One-Step RNA Purification Method 1、取小鼠，断颈处死，用剪刀沿小鼠枕骨断开小鼠颈椎，露出枕骨大孔，然后从枕骨大孔分别向两侧剪开小鼠颅骨，用镊子小心向上掰开顶骨，取出暴露的大脑。 （取出肝脏-20 冻存）实验步骤：第一天6 2、玻璃匀浆器中加入4ml的RNAiso试剂置冰上待用。 3、立即取出脑组织，移入玻璃匀浆器中，立即在冰浴中上下研磨

3、十次左右进行匀浆。 4、然后将匀浆液平均转移入4只2ml离心管中，室温静置5分钟。第一天7 5、加入0.4ml氯仿，盖紧管口，用力颠倒离心管3-5次进行混合，室温再静置5min后。 6、12000rpm 4离心10min；用移液器将上层水相分别转移入1.5ml离心管，每只600L。 7、加入600L异丙醇，颠倒混匀后室温静置5-10min，15000rpm 离心5min。第一天8 8.用移液器将上清去净后，加入1mL DEPC处理过的75%乙醇，振荡片刻，再于15000rpm离心5min；再次去净上清，敞口室温静置5-15min，待RNA沉淀略干。 9.每管中加入DEPC处理过的蒸馏水100L

4、溶解RNA， 4保存备用。 第一天9RNA含量的紫外分光光度计测定Determination of RNA contents by UV-Spectrometer 操作：取两只比色杯，一只加入1470L DEPC处理过的蒸馏水，再加入30L RNA液；一只加入1.5mL DEPC处理过的蒸馏水混匀后置紫外分光光度计中，分别测定其在260nm和280nm的光吸收值，计算出二者的比值与RNA溶液浓度。 第一天10一步法RT-PCR制备cDNAcDNA Preparation by One-Step RT-PCRRT-PCR采用一步RT-PCR试剂盒（TransGen Biotech)每组取一薄壁反

5、应管（200 uL）ComponentsVolumeRNA TemplateX uL（5ug）Forward Primer1 uLReverse Primer1 uL2HiFi PCR SuperMix 25 uLOne-step Enzyme Mix1 uLRNase-free Waterto 50uL反应体系：第一天11反应条件45 30min 水浴箱PCR仪94 2min94 30sec55 30sec 进行30次循环72 180sec72 5min第一天12载体DNA的酶切取1.5ml离心管，按下列表中所列加入组分： 1 载体DNADNA溶液（l ） 20 10 X 缓冲液 5 dH2

6、O 23 混匀后分别加入相应的酶Bam HI (GGATCC) 1 CIAP 1 混匀，37温浴 过夜 第一天13第二天用移液器将PCR反应液40 L转移入一只1.5mL离心管中，用于纯化。在PCR反应管中加入适量10 X 上样液（约1 L），用于电泳检测。14琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis 1、琼脂糖胶模的准备： 2、样品准备：向每一只样品管中加入9 uL样品、1 uL 10 X 上样液，混匀备用。第二天MRNAPCR第一组第二组第三组第四组15PCR产物（DNA）的纯化Purification of PCR product1.向装有PCR反应液的1.5

7、mL离心管中加入5倍体积（200 L）Binding Solution B, 上下颠倒混匀。2.将混合液转移到套放收集管的GenClean柱中，室温放置2min,于8000rmp离心1min。第二天163.取下GenClean柱，倒掉收集管中的废液。4.将GenClean柱重新放回收集管中，加入500 L Wash Solution，于12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。5.重复步骤4一次。第二天17 6.将GenClean柱重新放回收集管中，于12000rpm离心1min，以彻底去除Wash Solution。（开盖室温放置10min，将有助于Wash Solution中的乙醇

8、挥发干净）18 7.将GenClean柱放入干净的1.5mL离心管中，在GenClean柱吸附膜中央小心加入60 L Elution Buffer，37放置2min备用。（将Elution Buffer加热至65 将提高洗脱效率）19PCR产物的限制酶切 Restriction Digestion of DNA取1.5ml离心管，按下列表中所列加入组分： 2 PCR产物DNA溶液（l ） 43 10 X 缓冲液 5 dH2O - 混匀后分别加入相应的酶Bam HI (GGATCC) 2 混匀，37温浴 10min 第二天20DNA的乙醇沉淀纯化Purification of DNA by ac

9、hohol precipitation 向酶切反应管（载体及PCR)中加入50L TE，然后加入100L苯酚/氯仿，于振荡器上振荡10sec，然后15000rpm离心5min，将上层水相移入一只新离心管。第二天21再加入1/10体积（10L）的 3M NaAc和2倍体积（220L）的无水乙醇，混匀后于15000rpm离心10min；去上清后，加1mL 75%乙醇，再次离心1min，用移液器去净上清，将离心管敞口于室温静置5-15min干燥，然后加入20L TE缓冲液溶解DNA。 第二天22电泳法微量DNA定量分析 电泳方法同前，将胶中样品DNA区带的亮度与同一胶中标准DNA（Marker）的各

10、区带的亮度相比较，就可以估算出样品区带中的DNA含量。每一只样品管中加入5 uL样品、0.5uL 10 X 上样液，混匀备用。MVectorPCR第一组第二组第三组第四组第二天23DNA的重组连接 DNA Ligation 取一只1.5mL离心管，加入100ng 酶切PCR产物，100ng 酶切载体DNA和2L10 X 连接反应液，再加水至20L；混匀后，加入1U的T4 DNA连接酶，混匀后16保温4hr以上，然后4保存。 第二天24感受态细菌制备 Preparation of Competent Bacteria 1、细菌划盘培养：取一不含抗菌素的LB培养皿，将接种环于酒精灯上烧灼灭菌，冷却

11、后蘸取菌种于培养基上划线，然后将培养皿倒扣置37温箱中过夜培养，第二天早上取出置室温待用。第三天25 2、细菌过夜液态培养：第二天下午5点左右，取经过高压消毒的MA培养液10mL移入一100mL容积的三角烧瓶，加四环素至终浓度为10ug/mL；用200ml移液器从培养皿上取一个菌落接种于其中，37230rpm振摇过夜。第三天26 第三天，将100l过夜培养的菌液转移入10ml SOB培养液中，继续于37oC 230rpm振摇培养3-4hr，至菌液的OD600nm=0.4-0.6（细菌的指数生长期）。第三天27 3、感受态细菌制备： 取一1.5mL离心管（分别标记为管1、2），各加入1.4mL培

12、养细菌，冰浴中冷却10min后于415000rpm离心1min，去净上清，加入0.4ml感受态制备液A，上下吹吸悬浮细菌，然后置冰浴中15min；第三天284，15000rpm离心1min，去净上清，加入100L感受态制备液B，上下吹吸悬浮细菌，加入1L的1.4M巯基乙醇，混匀后置冰浴待用10min待用第三天29细菌转化 Transformation of Bacteria 1、向感受态细菌管1中加入5L连接反应液，向感受态细菌管2中加入1ng 的质粒DNA，混匀后置冰浴中静置30-45min；然后移入42热休克处理1.5min；再移入冰浴静置2-5min。 2、向各管中加入900L SOC培

13、养液，颠倒混匀，置37保温60min，每15min颠倒混匀一次。第三天30 3、铺盘： 对应于每一转化反应取两个含抗生素的MA培养皿，标记上组号和反应号，先将全部培养液转移入一培养皿，然后使其均匀分布于全平皿，再倾斜吸出多余的菌液移入第二个平皿中，同样处理使菌液均匀分布于培养皿上。第三天31 4、过夜培养： 将第一个培养皿倒扣，第二个培养皿正置于37温箱中过夜培养。第二天，取出培养皿，挑选菌落进行培养、提取DNA、和筛选；或者用封口膜封住培养皿，置4可以保存1-2星期。第三天32相关实验原理 RNA提取RNA酶易复活，不易彻底去除，使RNA极易降解。因此，在提取、保存、使用RNA的过程中，必须

14、时刻注意防止RNA酶污染问题。33一般采取预防为主的措施，所有与RNA接触的试剂、器材都需要去RNA酶处理。一般金属、玻璃制品可以于160oC加热2-6小时；塑料制品可以用氯仿、过氧化氢、DEPC处理；试剂和水可以用DEPC处理，然后再高压消毒除去残留的DEPC。此外，在操作方面需要注意快捷，尤其要缩短从处死动物到RNA提取开始这段时 34Total RNA 电泳照片35RT-PCR36DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类： （1）聚

15、丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 37（2）琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。38琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线