医学检测-产前(共14页)

1、以下(yxi)是简单整理的东西产前实验(shyn)流程解析.血浆分离(fnl) .DNA提取 .文库构建主要内容:血浆分离实验流程:1.预冷离心机。2.将全血按同的医院代码分类，记录各医院全血的流水号，然后置于4冰箱暂存。3.待离心机预冷至4，将全血样品置于离心机中（离心时注意严格配平），1600g离心10min。此过程可准备实验需要的中转管和最终管。4.离心完成后吸取上清液平均分到2个或多个已编号的2.0mlEP管中，注意核对样本编号及能吸到白细胞和红细胞，此过程需要在冰盒上操作，并严格对号。5.将上一步得到的血浆置于预先冷却至4的离心机，16000g离心10min，离心后将上清转入新的已编

2、号及贴好血浆条码2.0 mLEP管中，至少保证前3管体积为600ul，此过程同样需要在冰盒上操作，并严格对号。6.分离完成后制作(zhzu)产前血浆分离反馈表.注意事项1.全血样本必需在离体8小时内分离(fnl)完血浆。2.必需(bx)保证样本在低温条件下离心，离心时应严格配平。3.开启EP管盖时，注意能碰到EP管内盖。4.血浆分离结束后，若短期内无法将样本送往配送组入库，必需将样本置于-20 冰箱中暂存。5.离心机使用结束后应及时关掉电源。6.吸取上清时慢吸慢打，吸到中间层的白细胞，若吸到白细胞应将全血重新离心。7.去DNA清洗液为酸性溶液，能用于清洗离心机转子，以免腐蚀转子。8.实验所用E

3、P管架需定期用1 %盐酸浸泡过夜后洗净再使用。9.若实验室未配制DNA清洗液，可用10 %次氯酸钠代替，使用方法同DNA清洗液。问题问：第一步离心后，从采血管内吸取血浆时，吸到白细胞和红细胞，怎么处理？答：重新离心5-10min问:为什么要严格要求第一步分离(fnl)血浆时能吸到中间层的白细胞和红细胞？答：由于第二步高速离心会使得(sh de)有核细胞破裂，造成人体基因组DNA的释放，母体(mt)DNA背景过大，从而影响实验结果。问：为什么无创产前基因检测样品类型是血浆而选用血清？答：血清是添加抗凝剂而通过自体纤维蛋白原和凝血因子分离出来的上清液，血浆则是添加抗凝剂后析出的上清液。血清在血凝块

4、收缩时会导致细胞内DNA的释放，导致母体背景DNA过大，影响实验结果，而血浆内基质更稳定，可保存时间更长。DNA提取 原理：在高盐低pH的条件下通过硅胶膜特异吸附，将裂解液中的DNA吸附到硅胶膜上，去除杂质后用低盐洗脱液洗脱得到吸附在膜上的DNA。天根试剂盒DNA提取简易流程600 L血浆+10 L蛋白酶K加入600 LGBmix（GB：carrier RNA=1mL：10L），混匀56水浴10 min，取出后冷却5min，短暂离心加入300 L冷冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀将混合液转入提取柱中，8000rpm离心30s弃滤液，加入500 LGD，8000 rpm离心30 s弃滤液，加入500 L

5、PW，8000 rpm离心30 s（重复1次）弃滤液，12000 rpm离心2min将提取(tq)柱放在1.5 mL离心管上晾干3 min加入90L（其中(qzhng)5 L为损耗）TB溶解5 min，12000 rpm离心2 minQIAGEN试剂盒DNA提取简易(jiny)流程600 L血浆+10 L蛋白酶K加入600 LALmix（AL：carrier RNA=1mL：10L），混匀56水浴10 min，取出后冷却5min，短暂离心加入300 L冷冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀将混合液转入提取柱中，8000rpm离心30s弃滤液，加入700 LAW1，8000 rpm离心30 s弃滤液，加入5

6、00 LAW2，8000 rpm离心30 s弃滤液，12000 rpm离心2min将提取柱放在1.5 mL离心管上晾干3 min加入90L（其中5 L为损耗）AE溶解5 min，12000 rpm离心2 min提取试剂的作用蛋白酶K：裂解蛋白，核酸释放GB缓冲液：裂解细胞、提供稳定的高盐环境Carrier RNA：提高DNA不吸附柱上硅胶膜的结合，从而提高DNA的产率无水乙醇：沉淀DNAGD：去除蛋白等杂质PW：去除盐离子(lz)等杂质TB:溶解(rngji)回收DNA实验(shyn)细节1.GBmix配制加入carrierRNA之后，必须在瓶壁上标志并写上配制日期。2.GD、PW配制时，加入

7、无水乙醇后，必须在瓶壁上标志并写上配制日期。3.实验过程中加入GBmix、GD、PW之前应先检查是否加入了carrierRNA或者是否加入无水乙醇。4.倒扣套管用到的吸水纸要足够厚度，厚度以倒扣后废液渗过最后一层吸水纸为准；倒扣时，动作要轻柔，许磕管，同的样本许扣在同一个位置上。5.倒掉废液时，能接触吸附柱中间及底部吸附膜。6.实验过程中如手套污染，应及时用75%酒精清洁或者更换手套。7.倒废液时，若套管有污染，必须及时更换套管，防止污染累及吸附柱。8.血浆样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段偏小或者提取量降低。9.血浆溶解后必须保证在10min内加入PK及GBmix。10.为保证裂

8、解充分，血浆在加入PK和GBmix之后需要彻底混匀。11.乙醇残留会抑制后续(hux)的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。12.缓冲液GB若在未使用前有沉淀(chndin)，可在56温浴重新使其溶解，摇匀后再使用。13. DNA提取(tq)试剂盒在使用前必须检柖生产日期，若试剂盒已过期，则可用。实验特殊情况处理方法1、转管后未加入GD直接加入PW纯化：离心倒掉废液，从加GD步骤开始往下做，并在任务单上做记录，与统筹人员交接好便于跟踪样品。2、误把GB当成TB使用：再使用GD、PW纯化，TB溶解，并在任务单上做记录，与统筹人员交接好便于跟踪样品。3、TB溶解体积不当（180ul/100ul）

9、及时与统筹组人员沟通，便于统筹人员安排后续建库任务单的编排。文库构建原理从母体血浆(xujing)中提取的游离DNA，通过酶反应作用将DNA片段末端修复平整(pngzhng)；在3端加碱基“A”，使得DNA片段能不带有“T”碱基的特殊接头连接；最后通过PCR扩增技术引入带有特定(tdng)序列标签的DNA片段，并对各阶段产物进行纯化的过程。文库构建简易流程.建库类型：单枪建库、排枪建库.建库方弅：当天出库、连接过夜建库原理解析建库试剂(shj)作用.T4 DNA Polymerase:同时(tngsh)5 3DNA聚合酶活性及3 5外切酶活性；.T4 PNK: 5端磷酸化和3端去磷酸化；.Kl

10、enowFragment:具有5 3DNA聚合酶活性，对于(duy)单链有3 5外切酶活性，但比较弱。.Klenow（3-5exo-）：具有5 3DNA聚合酶活性，但失去了3 5外切酶活性。.T4 DNA Ligase：是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或者NAD水解提供能量催化DNA链的5-PO4不另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。.PfxDNA聚合酶：具有(jyu)3 5外切核酸酶校读活性，有快速的延伸速度，作为基础的热启动酶，具有很高的PCR反应特异性、灵敏度和产量。文库(wnk)质控峰图分析实验(shyn)细节1.吸取酶时用润洗吸头，加入体系混合(hnh)时需要反复吹洗，以确保

11、酶加入量准确。2.除PCR反应体系(tx)需要先加index再分装Mix外，其他各步均需先分装Mix再加模板，确定Mix剩余量无误后再加入模板。3.磁珠使用前应先从4冰箱取出，室温平衡30min后使用。4.磁珠分装过程需触底加入，出现挂壁情况，以保证磁珠量的准确性。5.模板不磁珠结合混匀时吸头要离开液面，尽量要产生气泡。6.磁珠纯化操作时操应扶稳磁力架不浅孔板，并且力度适中，防止将板弄翻。7.70%乙醇洗涤时，应往没有磁珠的方向缓慢加入乙醇，避免剧烈冲击磁珠而造成磁珠脱落，若发现磁珠被冲散，应等磁珠重新吸附后再洗涤。8. .乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以烘干时要确保乙醇挥发干净。9.使用数显

12、干弅加热器来烘干磁珠，温度为45。注意，此烘干温度是经过条件实验测试得出，许随意更改加热器中设定的温度。9.开启新一瓶磁珠、EB buffer、无水乙醇等试剂后需要在瓶壁注明开启日期。10.应注意观察建库使用试剂的保质期，使用过期试剂。实验(shyn)特殊情况处理方法1、前3步纯化(chn hu)多溶EB buffer：对于大体系，将多出来的部分按照(nzho)比例与mix结合、温浴，分别按比例纯化，在下一步合并；对于小体系，将多出来的部分按照比例与mix结合、温浴，合并一起进行纯化。2、PCR后纯化多溶EB buffer：相当于稀释文库，实验操作上无补救措施。需在共享交接表上填写的体积为实际

13、溶解的体积，并在任务单上记录，与统筹组人员做好交接，关注样品后续结果。3、index加入后，mix重复分装两次：再加入4ul index，混匀，吸出一半体积即可。4、DNA体积不足85ul：加入TB补足85ul5、DNA体积100ul若提前得知DNA体积是100ul，则需在编写建库任务单时按照相应的比例来调整mix的体积（由统筹组来编写任务单）；若在加入DNA时发现体积为100ul，则在相应的任务单上备注，并通知统筹组相关人员，以便跟踪样品情况。6、DNA体积180ul把多溶解的一半当做一个独立样品(yngpn)进行末端修复温浴和纯化，于加“A”后纯化时合并一起(yq)纯化，此时该孔的磁珠需分

14、装150ul。实验(shyn)质控1、目前产前阴性对照为2.5%，平行对照为5%。.设定阴性对照是为了排除其他因素对实验结果的影响。目前产前判断阴性对照合格的标准是阴性对照建库后测2100无目的片段，若阴性对照出现目的片段，则提示此次DNA提取和文库构建可信。2、设定环境评价用于评价实验室的清洁程度。环评样品检测标准是2100浓度小于10nmol/L.若浓度大于10nmol/L提示实验受环境污染风险高或者实验室有DNA片段残留。3、设定平行对照是用于评价实验操作的稳定性。实验室表格登记.每天进出实验室需监控实验室温湿度、冰箱温度，有相应的监测登记表格。.使用完仪器之后需做好清洁工作并登记相关仪

15、器使用记录以及对应每台仪器的维护记录。.血浆分离：湘仪冷冻离心机.DNA提取(tq)：水浴锅、离心机.建库：数显干弅加热器、恒温(hngwn)混匀仪、PCR仪。.值日记录：每天实验(shyn)完成后需清理实验室桌面和地面并登记值日记录。补充-实验室内务整治.一、实验装束（每人次扣该组当周质量分7分）：.1、进入临检实验室等高级防护区域，必须正确穿戴口罩、帽子、鞋套、实验服。.2、进入电泳室、3730检测区实验室等普通防护实验室，必须穿戴好实验服，穿露脚趾的拖鞋、高跟鞋等。.二、实验室使用（每人次扣该组当周质量分5分）：.1、PCR实验室内通道，必须按从上游到下游指示行走。.2、参观通道门口为消防逃生应急门，禁止日常出入。.3、实验员在实验室睡觉、进食、储存食物