WesternBlottingProtocol-中山大学参考教学教材

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。WesternBlottingProtocol-中山大学参考WesternBloting(张雪雁)操作步骤：做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加巯基乙醇，然后以PCR仪95变性10分钟。上样、电泳：上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。将SD

2、SPAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。1电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。先以少量加有溴酚蓝1上样缓冲液标记各泳道。变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1上样缓冲液补齐至50ul。蛋白Marker也补齐至50ul。以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉

3、理清楚。溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。电转：准备PVDF膜及滤纸。PVDF大小8.255.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡13分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。一般小分子量适合低电压，大分子量适合高电压。5.封闭：电转完毕后取出PVDF膜，置于

4、5%的脱脂奶溶液中封闭。一小时或者4过夜。一抗反应：将抗体以10ml5%脱脂奶适合稀释，将PVDF膜浸入其中，置于脱色摇床上促进反应1小时。表达丰度低的蛋白可适当加长时间，比如4冷库过夜。6.回收抗体。7.TBST液摇洗膜，15分钟3次8.二抗反应：相应二抗以1：2000比例稀释至10ml。PVDF膜置于其中要洗4050分钟。9.TBST液洗膜，15分钟3次10.暗房发光洗片。所需物品：滤纸，保鲜膜，压片盒，X光片，小镊子，1000ul移液器，枪头，配制发光液，solution：solution=1:1，一张膜需要2ml。1）用纸吸干PVDF膜水分，在保鲜膜上浸泡于发光液1分钟，期间用镊子翻转

5、几次促进均匀反应。用纸吸干PVDF膜上剩余的发光液，裹于干净的保鲜膜里，只需一层。2）PVDF膜平铺于压片盒，关灯，取X光片12张铺与其上，扣紧压片盒。根据需要定制曝光时间。一般第一张15分钟。将剩余X光片密封避光保存妥善。3）取出压片盒中X光片投入自动洗片机中冲洗。WesternBloting相关试剂：Acrylamide/Bisacrylamide30%(w/v)acrylamide(丙烯酰胺)(Bio-Rad161-0101)0.8%(w/v)methelenebisacrylamide(N-N亚甲基双丙烯酰胺)（Gibco155-16-024）丙烯酰胺（Acr）29g亚甲基双丙烯酰胺(

6、Bic)1g超纯水至100ml37下溶解后，4brownbottle保存，使用时恢复至室温且无沉淀。4LowerTris500mlTrisbase(1.5M,m.w.121.1)90.83g10%SDS20ml超纯水至500mlPHto8.8(aboutHCL12ml)4UpperTris,200mlTrisbase（0.5M）12.12g10%SDS8ml超纯水至200mlPHto6.8(aboutHCL8ml)10%AmmoniumPersulfate(过硫酰胺，APS，10%，W/V)（Bio-Rad161-0800）总量10mlAmmoniumPersulfate1gDH20to10m

7、l溶解后，分装后-20保存，每次用一支（200ul），保存时间为一周。Temed:2SampleBuffer,50mlGlycerol10ml20%SDS15ml4UpperTris12.5mlH2Oto50ml1SampleBuffer1.5ml2ml3ml4ml5ml10ml20ml50mlH2O(ml)0.6750.91.351.82.254.5922.52S.B.(ml)0.7511.522.551025BME(ul)751001502002505001000250010RunningBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)576g288g144gTrisbase

8、(GIBCOBRL15504-038)120g60g30gSDS(GIBCOBRL15525-017)40g20g10g加dH2O至相应的容量。1RunningBuffer10RunningBuffer和dH2O按1:9比例配置，溶解后室温保存；溶液可置于4重复使用3次。10TransferBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)580g290g145gTrisbase(GIBCOBRL15504-038)116g58g29g加dH2O至相应的容量。1TransferBuffer,2000mldH2O1400ml;20%methanol(甲醇)400ml1Transfer

9、Buffer200ml混匀。溶解后室温保存；溶液可置于4重复使用3次。10TBS(PH7.6)4L2L1LTris96.8g48.4g24.2gNacl320g160g80g36%HCL5058ml1TBS-T，2000mldH2O1800ml1TBS200ml吐温-202ml（或20%吐温10ml）（临时加入），混匀。1TBS缓冲液（可参考）1mol/LTrisHCL(PH7.5)10mlNaCl8g蒸馏水至1000ml10PBS4L2L1LNacl320g160g80gKCL8g4g2gNa2HPO457.6g28.8g14.4gKH2PO49.6g4.8g2.4g加dH2O至相应的容量0

10、.01mol/LPBS缓冲液(ph7.2-7.4)（可参考）0.2mol/LNaH2PO419ml0.2mol/LNa2HPO481ml蒸馏水至2000mlStrippingBuffer10ml50ml100ml200ml500ml1mol/vTrisHCL(PH6.7)(ml)0.62510%SDS(ml)214.4mol/l-巯基乙醇0.07dH2O(ml)*7.305*3.1256.2512.531.251020401000.350.71.43.536.525*73.5*146.1*365.25*加dH2O至相应的容量。-巯基乙醇在Strip前临时加入。配置时，在通风厨内进行。4保存，可

11、重复使用1次。（Stripping步骤：用StrippingBuffer在50洗膜10min,之后于室温下在TBST中洗膜3次，每次10min.封闭后开始加相应抗体）附：其他部分试剂配制：母液1mol/LTrisHCLTris(MW121.14)30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至所需点（如下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。PHHCL约17ml约16ml约15ml约10ml1.74mg/ml(10mmol/l)PMSFPMSF0.174g;异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，20保存。0.2mol/lNaH2PO4NaH2PO4(MW1

12、19.98)12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/lNa2HPO4Na2HPO412H2O(MW358.14)71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。10%SDSSDS10g蒸馏水至100ml50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10%过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4保存，保存时间为一周。TrisHCL（PH8.8）Tris（MW121.14）15.13g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至8.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。0.5mol/lTrisHCL（PH

13、6.8）Tris(MW121.14)15.14g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调PH至6.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。20%Tween20Tween2020ml蒸馏水至100ml混匀后，4保存。使用液单去污剂裂解液（50mol/lTrisHCL（PH8.0），150mmol/lNaCL,1%TritonX-100,100ug/lPMSF）:1mol/lTrisHCL（PH8.0）2.5mlNaCL0.438gTritonX-1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMS

14、F50ul)。G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250：100mg95%乙醇50ml磷酸：100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存0.15mol/lNaClNaCL(MW58.44)0.877g蒸馏水至100ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/lNaCl1ml溶解后，-20保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/lNaCL进行100倍稀释1mg/ml,，-20保存还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/lTrisHCL（PH6.8），0.5mm

15、ol/l二硫叔糖醇,10%SDS,0.5%溴酚蓝，50%甘油）0.5mol/lTrisHCL（PH6.8）2.5ml0.5mmol/l二硫叔糖醇0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存10X丽春红染液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g蒸馏水至100ml使用时将其稀释10倍。封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）脱脂奶粉2.5gTBST50ml溶解后4保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。显影液（5X）自来水（5060）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g亚硫酸钠（无水）15g冰乙酸

16、12.6ml硼酸7.5g钾明矾15g(水温冷至30以下再加入)加水定容至1000ml，室温保存。WesternBlotting配胶6%SsperationGel7.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)123415L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.725.438.1510.8740.75APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)1.252.53.75518.75L.T.(ml)1.252.53.755

17、18.75H2O(ml)2.474.937.49.8737APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13389%SsperationGel10.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)1.534.5622.5L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.724.46.68.833APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)1.753.505.257.0026.25L.

18、T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)246830APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.133812%SsperationGel13.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)246830L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)1.733.745.206.9326.00APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)2.254.56.75933.75L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)1.472.934.45.8722APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.133815%SsperationGelStackingGel5ml10ml15ml20ml75mol2ml4ml5ml8ml30mlAcry1(ml)2.557.51037.5L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)1.232.455.206.9326.00A