生物实验知识bac文库构建

1、()BAC 文库构建技巧(2011-07-21 09:39:20)组 DNA 文库构建实验技巧组 DNA 文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的片段，用以表达调控、人类及动植物组工程的研究。通常情况下组文库构建的基本流程可以归为 4 大步骤：分离组 DNA、对组 DNA 作相关的处理、将组 DN段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。一、分离组 DNA（gDNA），优质的组 DNA 对于组文库构建是的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的组 DNA 分离方法，在分离过程中保证 DNA 不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证 DNA的纯度。二、处理组 DNA根据研究目的，研究者需要选择合适

2、的载体。不同的载体对组DNA 的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的组 DNA 来构建组文库。比如，对于黏粒载体（比如tre 的 pCC1FOSTM、pFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为 40kb；对于 BAC 载体（比如centre 的 pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为 120kb-300kb。构建黏粒组 DNA 文库，研究者需要将组 DNA 用注射器来随机剪切 DNA；接着用末端修复酶修复 DNA，可以提高 DNA 连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到 40kb 左右的DNA片段，随后

3、使用centre GELase 胶回收试剂盒回收 DNA。构建 BAC组 DNA 文库，研究者需要将组 DNA 用限制性内切酶（常用 EcoR I、BamH I 或者 Hind III）来消化组 DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的 DN段（比如 100kb-150kb），随后透析回收 DNA。需要注意：（1）电泳时，要选用合适的 DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的 DNA。用centre 试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的 Control Insert DNA 来做 marker，既方便又准确。（2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标 DNA，紫外

4、光照射 DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把 marker 所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。（3）回收 DNA 的时候，应该要避免过度离心，以防止 DNA 被剪切，降低文库质量。三、载体的选择目前，常用的组文库载体有黏粒载体、P1 噬菌体载体、PAC 载体（P1 人工）、BAC 载体（细菌人工）和 YAC 载体（酵母人工）。选用何种载体可以参考如下几个：1目标区域的大小如果组的目标区域很小（小于 50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是 噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。如果组

5、的目标区域比较大，那么 P1、PAC 或者 BAC 就比较合适了。P1 操作比较，PAC 相对简便。BAC 载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建 BAC 文库，比如CENTRE 公司的一系列 BAC 载体及配套试剂盒。如果目标区域非常大（大于 250kb），那么 YAC 载体就是首选了。不过，应用 YAC 载体来构建组文库，操作非常繁琐，一般由专门的公司来完成。表 1 各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化2筛选文库的难易程

6、度黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如 P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用 PCR 进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少步查的步骤。3.载体拷贝数的考虑：当把大片段 DN段克隆到高拷贝的载体时，克隆 DNA 会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量 DNA 是高通量分析的瓶颈。这个常常困扰着研究者。而CENTREs CopyControlTM 克隆系统是对这些的最好的解决方案。CopyControlTM 技术整

7、合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的 DNA。四、将组 DN段连接入载体使用连接酶把上述大小合适的 DN段连接入载体。centre 的商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。连接酶可以选用centre Fast-Link DNA Ligase，连接快、效率高。连接反应体系以 100ul 为宜。注意：BAC 载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。脱盐可以用centre的 Agarose Cone方法，省时省力，防止 DNA 被剪切。五、将

8、重组载体转入宿主细胞如果使用centre 试剂盒构建黏粒文库，需要用centreMaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染centre300-T1?Plating Strain。挑出重组子，鉴定片段的大小。如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。如果使用centre 试剂盒构建 BAC 文库，应选择电转法，可以选择centre TansforMaxTM300TMpetent E.coli 作为宿主，将上述连接产物转入细菌，涂板长出克隆后。获得克隆，研究者需要对 BAC 克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。centre 文库构建试剂盒中的Lyse 和Blue，快速裂解克隆并电泳，可以方便的鉴定出 BAC 克隆的大小，从而估计出 BAC文库的大小。如果文库大小合适，那么这个文库就可以进行后续的操作了。六、文库克隆数的确定组 DNA 文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P 是希望得到的覆盖率，f 是片段大小与组 DNA 大小的比值，N 是所需的克隆数。举例来说，用 BAC 载体构建人类组文库，人类组大小为 3 x109 b