重金属对微生物毒性效应研究-供参考

1、武汉工业学院毕业论文论文题目：重金属对微生物毒性效应研究姓 名 学 号 院 系化学与环境工程学院 专 业 环境工程 指导教师 2010年5月15日目 录中文摘要.英文摘要.1.前言.11.1 重金属对微生物毒性研究现状.11.2 本实验研究的目的和意义.32大肠杆菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的简介 .42.1 大肠杆菌的简介.42.2 荧光假单胞菌的简介.42.3 枯草芽孢杆菌的简介.53汞，铬，镉，铅对大肠杆菌，荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌毒性的实验研究.73.1 细菌在重金属污染下存活数量.73.1.1 实验材料和仪器.73.1.2 实验步骤.73.1.3 结果与分析.73.2 细菌在受到

2、重金属污染后在细胞水平上的研究.93.2.1实验材料和仪器.93.2.2 实验步骤.93.2.3 结果与分析.103.3 单细胞凝胶实验.123.3.1 实验材料和仪器.123.3.2 实验步骤.123.3.3 结果与分析.134微生物和重金属相互作用的应用范围及发展前景.154.1 微生物和重金属相互作用的应用范围.154.1.1 重金属污染的微生物学评价.154.1.2 微生物在环境保护中的应用.154.2 重金属和微生物相互作用的发展前景.16谢辞.17参考文献. 18摘 要微生物不仅种类繁多，数量极大，分布广泛，而且具有繁殖迅速，个体微小，比表面积大，对环境适应能力强等特点，因而成为人

3、类最宝贵、最具开发潜力的资源库之一。作为分解者，微生物在地球生态系统的物质循环过程中起着“天然环境卫士”的作用。众所周知，重金属不能被微生物降解并且对它们有毒害作用，本次实验是以四种常见的重金属离子、对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌生长过程的毒性研究。实验由三个部分组成：将三种细菌在含有不同浓度的、的固体培养基中培养，通过计数的方法以确定每种金属对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌的最小致死浓度；在荧光镜下观察经重金属污染后的细胞形态与原细胞形态的区别，确定重金属是否对细胞形态有影响；对经重金属污染的细菌DNA进行单细胞凝胶实验，以确定重金属是否对细菌的遗传物质产生损伤。实验结

4、果表明：重金属离子对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度5、3、3；对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度为20、120、180；对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度为90、30、30；对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度为300、250、200。关键词:重金属，大肠杆菌，荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌，毒性AbstractThe microorganisms are not only widespread with a wide range and a great numbers; but also ha

5、ve characteristics of rapid propagation, a small individual, large surface area and a great adaptability to the environment and so on. So the microorganisms have become one of resources of the most valuable, the most potential for development. As a decomposer, microorganisms play the role of “Guardi

6、an of the natural enviroment”in the material cycle of terrestrial ecosystems.As is known to everyone, heavy metals cant be decomposed by microorganisms and have toxic effects on them. This experiment researched the toxicity of four common heavy metal ions: 、on the growth of Escherichia coli,Pseudomo

7、nas.fluorescens and Bacillus subtilis.The experiment consisted of three parts:determination of the most lethal concentration of each metal on the E.coli,P.fluorescens and B.subtilis by counting CFU method; observation of cell morphology after exposure to heavy metals by microscopy; detection of dama

8、ge of DNA by single cell gel electrophoresis.The results showed that the minimum lethal concentration of E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 5、3、3 ,respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal

9、ions is 20、120、180 respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 90、30、50,respectively; the minimum lethal concentration of E.coli,P.Fluorescens and B.subtilis were polluted by heavy metal ions is 300、250、200， respectively.

10、Key words：heavy metal，E.coli,P.fluorescens,B.subtilis,toxicity1.前言1.1 重金属对微生物毒性研究现状重金属污染指由 HYPERLINK /view/1208.htm t _blank 重金属或其化合物造成的环境污染。主要由采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属制品等人为因素所致。如日本的 HYPERLINK /view/42227.htm t _blank 水俣病和痛痛病分别由汞污染和镉污染所引起。其危害程度取决于重金属在环境、食品和生物体中存在的浓度和化学形态。重金属污染是当今世界三大水环境污染方式之一。重金属污染物主要包括汞、

11、铬、铅、锌、铜、镍等，其种类、含量及其存在形态随产生条件而异 。同时，重金属元素中许多为生物体正常生长所必需的元素，但大部分具有毒性且是致癌因子，过量排放到环境水体中容易破坏生态平衡，并通过食物链富集危害人类健康，因而水体的重金属污染治理逐渐成为人们研究的热点问题。重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。以各种化学状态或化学形态存在的重金属，在进入环境或生态系统后就会存留、积累和迁移，造成危害。如随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝的

12、体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害。如日本的水俣病，就是因为烧碱制造工业排放的废水中含有汞，在经生物作用变成有机汞后造成的；又如痛痛病，是由炼锌工业和镉电镀工业所排放的镉所致。汽车尾气排放的铅经大气扩散等过程进入环境中，造成目前地表铅的浓度已有显著提高，致使近代人体内铅的吸收量比原始人增加了约100倍，损害了人体健康。微生物不仅种类繁多，数量极多，分布广泛，而且具有繁殖迅速，个体微小，比表面积大，对环境适应能力强等特点，因而成为人类最宝贵、最具开发潜力的资源库之一。作为分解者，微生物在地球生态系统的物质循环过程中起着“天然环境卫士”的作用。它们几乎能降解或转化环境中存在的各种天然物质，一旦

13、新的物质出现，也能逐步通过自发或诱导产生新的酶系，具备新的代谢功能。可以说，只要找到合适的微生物并给予适宜的条件，所有的污染物都可以得到降解和转化。众所周知，重金属不能被微生物降解并且对它们有毒害作用，但是微生物对重金属又有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和转化重金属。两者间相互作用的研究可为湿法冶金、环境污染评价及生物净化提供理论依据。近年来，正是基于微生物对重金属的积累和解毒作用，以净化有毒金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日益成熟，微生物是现代工业发展的坚强后盾。微生物巨大的环境保护功能(生态毒理评价和生物修复)显得越来越重要。因而研究重金属对微生物的毒性效应在环境工程中的

14、应用将有着重大的意义，它是微生物应用的基础实验数据，并为其应用提供参考。已经有很多的学者对重金属对微生物的毒性进行了研究。研究包括以下几个主要方面：1)重金属对微生物群体的影响重金属污染能够明显影响土壤或水域中微生物群落，如降低微生物生物。降低活性细菌菌落的数量等等，同时重金属污染亦能明显影响微生物群落结构，即微生物多样性，已有研究表明微生物群落结构的变化能较早地预测土壤或水域中养分及环境质量的变化过程，被认为是最具潜力的敏感性生物指标。如王秀丽等以铜锌冶炼厂附近的水稻土为例，研究了重金属复合污染对土壤微生物群落的影响。结果表明，铜、锌、镉、铅与微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物商、微生物

15、生物量氮/全氮均呈显著负相关，重金属污染均能降低细菌、真菌和放线菌的数量。用BILOG生态盘研究了重金属污染对微生物群落结构的影响，发现重金属污染明显影响了微生物群落结构。2)重金属对微生物个体的影响低浓度的重金属可刺激微生物生长，而高浓度的重金属可抑制微生物的生长繁殖，甚至导致微生物死亡。某些非生物学功能的金属如Hg、Ag、Cd等在其浓度很低时即有高毒性。Hg的毒性主要表现为：抑制生物大分子如蛋白质和核酸的合成，致突变效应，停止细胞分裂，抑制生物氧化及运动性。Cd也具有致突变效应，导致DNA链断裂。Pb可造成细胞膜损伤，破坏营养物质的运输。高浓度的Mn干扰细胞对的运输，过量的Ni抑制酵母乙醇

16、脱氢酶的活性。Hosfall总结出金属阳离子的毒性顺序：AgHgCuCdNiCoZn，并指出这种顺序可因生物种类不同而略有差异。金属的毒性还与其自身的化学性质和金属硫化物的不溶性顺序有关。事实上，两者的顺序非常相似，即HgAgCuPbCdZn。金属的毒性还与其价态或配基有关。Hg相对于Hg而言毒性要大，而有机汞如甲基汞的毒性是无机汞的100多倍。As的毒性比As高200多倍，Cr毒性也高于Cr。3)重金属对微生物的毒性机理重金属对活的微生物作用分两个阶段进行，第一是伴随着离子结合和电势增加的生化吸附，第二是离子被吸附在随着电荷减少而发生阴性改变的细胞表面。重金属对微生物的最重要毒性作用是使带有

17、机能基因硫氢基的酶的失活。许多重金属表现出对其他生物配位体如磷酸、嘌岭、嘧啶和核酸的强烈亲和力，有的还可以作为抗代谢物，或成为与细胞膜结合的物质。现在随着分子生物学的发展，重金属对微生物毒性机理的研究也已经深入到了分子水平，而不只停留在细胞水平。关于重金属生物中毒的分子机理，目前还未很好地弄清楚，但是从大量的生物毒性试验结果可以推测，毒性是由于重金属与生物大分子作用造成的。金属离子既可取代生物大分子活性点位上原有的金属，也可以结合在该分子的其他位置。当有毒金属离子与生物大分子上的活性点位或非活性点位结合后，可以改变生物大分子正常的生理和代谢功能，使生物体表现为中毒现象甚至死亡。4)微生物对重金

18、属抗性的研究当重金属超过一定浓度时，对微生物具有毒害作用，但是某些微生物可以通过生物解毒对重金属毒性产生抗性。重金属生物解毒是指微生物把抑制其正常生长繁殖的有毒重金属通过运输、结合与转化等方式使细胞内重金属减少、毒性减弱并对重金属毒性产生抗性的生理代谢过程。研究表明，不同类型的微生物具有不同的解毒抗性，如真核微生物，主要通过利用金属硫蛋白(Metallothionein，MT)螯合体内重金属，以减少破坏性较大的活性游离态重金属的存在；而原核微生物则通过减少重金属的摄取，增加细胞内重金属的排放来控制胞内金属离子浓度。实验证明，白色链珠菌(Candida albicans)主要利用由Crdl基因编

19、码的P1型ATP酶向体外运输铜，当去除菌体内所有Crdl时，C. albicans便丧失铜抗性。1.2 本实验研究的目的和意义重金属的转化、净化一直是治理被污染环境的难点。近年来，对被重金属污染的环境进行生态恢复的思想和研究实践有所加强。由于微生物种类多、数量大、分布广、繁殖快、变异适应力强，成为最受关注的生态恢复生物类群。目前，已有很多关于微生物吸附和富集重金属离子、转化重金属化合物的报道，如假单胞菌和金色葡萄球菌固定银、枯草杆菌固定金和硒、硫弧菌和柠檬酸菌固定多种金属、绿藻固定多种金属、氧化亚铁钩端螺旋杆菌氧化还原多种金属化合物等，其中，绿藻对水溶液中的镉、汞、铅、铬的去除率可达96以上。

20、但在重金属对微生物的毒性效应方面没有系统的阐述。因此，本实验的研究可了解到汞，铬，镉，铅工业废物中常见的重金属对微生物生长过程中毒性效应，具体阐明了重金属对细菌群体数量、细胞形态及细胞遗传物质的影响，从而对重金属对微生物毒性效应研究及重金属对环境污染的微生物学提供了一定的依据，同时为重金属的生物处理技术也提供了基础资料。2.大肠杆菌、荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的简介2.1 大肠杆菌的简介大肠杆菌(Escherichia coli， HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli)是肠杆菌科细菌的模式种(type species)。为革兰氏阴性的直杆菌，周身

21、鞭毛运动或无运动，兼性厌氧，最适合生长温度为37。在营养琼脂上的菌落为光滑型(S)、低凸起、湿润、灰白色、表面有光泽。边缘整齐，在生理盐水中易乳化；亦可为粗糙型(H)菌落，干燥，在生理盐水中不易乳化；也可有中间型菌落；亦有黏液型菌落。化能异养菌，氧化酶阴性，能以乙酸盐为唯一碳源，但不能利用柠檬酸盐。大肠杆菌能发酵葡萄糖及其他糖类产生丙酮酸，并可进一步转化为乳酸、乙酸和甲酸，部分甲酸可被复合的解氢酶系统分解为等量的二氧化碳和氢气。有的菌株不产气，大多数菌株发酵乳糖，但可迟缓发酵或者不发酵，大肠杆菌存在于温血动物肠道下部。大肠杆菌为两端大肠杆菌为两端钝圆的短杆菌，一般大小约0.5-0.8um3.0

22、um。因环境条件不同，有时个别菌体呈近似球状，也有时出现长丝状。多单独存在或成双，但不形成长链排列。约有5左右菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，所以动力较弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛；有时菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽孢。对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色呈阴性。图2-1 显微镜下的大肠杆菌2.2 荧光假单胞菌的简介1.菌落特性荧光假单胞菌（P.fluorescens）是假单胞菌属（Pseudomonas）的一种，革兰阴性杆菌，呈单个或成对排列，一端丛毛菌，运动活泼，偶见无鞭毛无动力的菌株。专性需氧，营养要求不高，在普通培养基上可生长，在麦

23、康凯和SS平板上亦可生长，最适生长温度为25-30，大多数菌株在4生长，37或42不生长。约94%的菌株产生水溶性荧光素（青脓素），在紫外线（360nm）照射下呈黄绿色荧光，有些菌株产生蓝色色素，不扩散。氧化酶阳性，氧化葡萄糖、木糖产酸，对麦芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明胶，卵磷酯酶阳性。图2-2 高倍显微镜下的荧光假单胞菌2临床意义荧光假单胞菌（P.fluorescens）存在于土壤和水等环境中，常与食物（鸡蛋、血、牛乳等）腐烂有关，可作为咽部的正常菌群存在，是人类少见的条件致病菌，偶从泌尿道感染病人尿中分离出。由于具有嗜冷性，可在冰箱储存血液中繁殖，若输入含有此菌的血库血液，可导致病

24、人不可逆性的休克而死亡。3微生物学检验尿、分泌物等临床标本可直接接种在血平板上，血液标本可先于20-30进行增菌后再接种血平板分离。不能在35或37进行培养，以免发生假阴性。本菌鞭毛3根以上，42不能生长，不产生绿脓素，可以与铜绿假单胞菌相区别。本菌的最低鉴定特征有：单端鞭毛3根以上，动力阳性；氧化分解葡萄糖，不分解麦芽糖，氧化酶阳性，精氨酸水解阳性，明胶液化阳性。2.3 枯草芽孢杆菌的简介枯草杆菌（Bacillus subtilis，B.subtilis），芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.8m23m，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。 图2-3 显微镜下的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌是革兰

25、氏阳性菌，芽孢0.60.9m1.01.5m，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。最适合生长温度为37。3. 汞，铬，镉，铅对大肠杆菌，荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌毒性的实验研究3.1 细菌在重金

26、属污染下存活数量3.1.1 实验材料和仪器实验材料：大肠杆菌DH5，荧光假单胞菌AB92001，枯草芽孢杆菌，由武汉大学生命科学学院提供；，分析纯，北京益利化工公司；，分析纯，贵州市铜仁化学试剂厂；，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；，分析纯，天津华东试剂厂；蛋白胨(LP0042),英国，OXOID；酵母粉(YEAST EXTRCT)，英国，OXOID；，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；琼脂(Agar)，日本。实验器材：恒温培养箱；高压灭菌锅；电子天平；超净工作台；培养皿；三角瓶；试管；酒精灯；涂棒。3.1.2 实验步骤用,的分析纯，分别配置、的溶液1000mg/L，pH自然。配置LB液体

27、培养基(5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)800mL，分装在8个三角瓶中(每个100mL)，再在每个三角瓶中加入1.1g琼脂，然后放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌完后，在其中7个三角瓶中加入经稀释后不同浓度的离子，混合均匀后，将培养基倒入培养皿中(每种浓度倒3个平板，包括空白样)，冷却。将原菌种液用已灭菌的LB液体培养液稀释倍，振荡均匀后，分别取20L的菌液加入到每个培养皿中，涂抹均匀后，倒置放入恒温箱中培养18小时(大肠杆菌37，荧光假单胞菌30，枯草芽孢杆菌37)。培养完成后，通过计数法，数出每个平板上的菌落数，与空白样对比，计算出每种浓度金属离子的致死率。将每种金属对三种菌种重复以上

28、过程。3.1.3 结果与分析1实验结果：重金属离子对三种细菌的致死率如表3-1所示：表3-1 重金属对三种菌的致死率重金属离子剂量(mg/L)对大肠杆菌的致死率（%）对荧光假单胞菌的致死率（%）对枯草芽孢杆菌的致死率（%）01.02.03.05.020.050.090.005.020.050.090.0120.0150.0180.005.020.030.040.0020.0029.666.777.8100100100100082.41001001001001001000011.129.663.300032.270.0100100100100100013.340.073.393.31001001

29、00025.971.110010000087.590.6100100100100100000045.684.490.61000093.893.896.90050.090.0120.0150.0180.0200.0250.0300.00011.125.944.468.989.71000013.352.277.890.5100100050.990.693.896.91001001002结果分析与讨论由表3-1中数据可知：重金属离子对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度5、3、3；对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度20、120、180；对大肠杆菌、荧光

30、假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度90、30、50；对大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的最小致死浓度300、250、200。通过上表，我们知道在重金属离子、浓度相同时，它们对大肠杆菌的毒性强度依次为：；对荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的毒性强度都依次为：。由此可见，对微生物的毒性最大。3.2 细菌在受到重金属污染后在细胞水平上的研究细菌在受到重金属污染后在细菌水平上的研究主要是通过比较三种细菌(大肠杆菌，荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌)在受重金属污染前后细胞形态的改变来确定。根据表3-1中实验结果，对微生物的毒性最大，故预选经1mg/L的污染后的细菌作为研究对象，但由于本实验中用

31、到的培养基为LB液体培养基，与上述固体培养基不同，在经1mg/L的污染后的菌体全部死亡，故选择经50mg/mL的污染后的菌体作为本实验得研究对象。3.2.1实验材料和仪器实验材料：大肠杆菌DH5，荧光假单胞菌AB92001，枯草芽孢杆菌，由武汉大学生命科学学院提供；，分析纯，贵州市铜仁化学试剂厂；蛋白胨(LP0042)，英国，OXOID；酵母粉(YEAST EXTRCT)，英国，OXOID；，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Goldview染色剂，鸿雨新生物科技有限公司。实验仪器：显微镜型号BGP33-IX71(olympus)；3.2.2 实验步骤将分离得到的三种细菌进行细胞形态观察，依据

32、参考文献所述方法进行。从平板上用牙签挑单菌落进行液体过夜培养，37，180rmp；从过夜培养的液体培养物中以1%的接种量转接到新鲜培养基中，培养8h，37，180rmp；向其中加入，终浓度为50mg/mL，静置处理12h；用移液器吸取1mL的上述处理液于1.5mL的EP管中，于4000rmp离心5min；倒上清后将细菌重新悬浮在pH7.5的PBS缓冲液中；用Goldview对细菌染色5min；制片并用荧光显微镜观察细胞形态。3.2.3 结果与分析 1、实验结果：在荧光显微镜下各菌体的细胞形态如下图所示；图3-1 荧光显微镜下未经污染的 HYPERLINK /view/702098.htm t

33、_blank E.coli细胞形态图3-2 荧光显微镜下经污染后的 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli细胞形态图3-3 荧光显微镜下未经污染的P.f.AB92001细胞形态图3-4 荧光显微镜下经污染后的P.f.AB92001细胞形态2结果分析与讨论图3-1和图3-2分别为大肠杆菌受重金属离子污染前后细胞的形态，由两图对比可知，在图3-1和3-2中大肠杆菌都呈明显的杆状，但图3-2中细胞相对来说杆大并且粗壮，这可能是因为重金属引起大肠杆菌的细胞壁在不同程度上破裂，使得细胞膨胀导致而成的。图3-3和3-4分别为荧光假单胞菌受重金属离子污染前后细胞

34、的形态，由两图对比可知，图中的荧光假单胞菌都也呈明显的杆状，但它们在此倍数的显微镜下没有明显的差别，因此无法确定重金属离子对其细胞形态是否有影响。对于枯草芽孢杆菌而言，因为其体内含有溶菌酶，在含有受重金属污染菌体的培养基静置处理时，由于其细胞受到严重损伤，造成溶酶体破裂，溶菌酶被大量的释放，枯草芽孢杆菌发生自溶，因此实验中无法用荧光显微镜观察它在经污染前后细胞的形态变化。3.3 单细胞凝胶实验单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)，又称彗星实验，是一种在单细胞水平上进行DNA损伤的检测方法，具有简便、灵敏、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检

35、测、环境毒性检测、分子流行病学和DNA损伤与修复等研究领域。本实验中，用单细胞凝胶实验来确定重金属污染是否对菌体的遗产物质产生损伤。本实验中是根据对菌体遗传物质的研究来确定重金属污染时，是否对其遗传物质有所影响。根据实验二中的结果，本实验只就大肠杆菌DH5和荧光假单胞菌AB92001进行单细胞凝胶实验。3.3.1 实验材料和仪器实验材料：磷酸盐缓冲液(PBS)；低熔点琼脂糖，Pharmacia，丹麦；正常熔点琼脂糖，Pharmacia，丹麦；(三羟甲基)氨基甲烷(Tris)，北京益力精细化学品有限公司；碱性裂解液（2.5mol/L NaCl；100mmol/L Na2EDTA；10mmol/L

36、 Tris；1%肌氨酸钠），临用前加10%DMAO，1%Triton X-100；电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA；300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH=7.5）；溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储于室温即可。实验仪器：移液管；电泳槽；电泳仪；微波炉；载玻片；盖玻片；凝胶成像系统。3.3.2 实验步骤大肠杆菌DH5和荧光假单胞菌AB92001的活化。用100mL已灭菌的LB液体培养基，接入2mL的已活化的 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5和p.f. AB92001，分

37、别置于37和30的摇床中培养12-18h；染毒。将活化的菌液稀释10000倍后，去20L的菌液加入5mL含有50mg/mL的的LB液体培养基中培养一段时间。破壁。加人2mol/L的NaOH溶液，破壁40min，离心；制片 。第一层：滴加80L正常熔点琼脂糖溶液，盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，然后放人冰箱内或碎冰上4 1015 min待其凝固；第二层：取轻轻揭去第一层盖玻片，将细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶(37)按1:9的比例混合，在载玻片上滴加65L，盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，然后放人冰箱内或碎冰上41015 min待其凝固；第三层：轻轻揭去盖玻片，在载玻片滴加65L低熔点琼脂糖溶液，盖上盖

38、玻片，然后放人冰箱内或碎冰上41015 min待其凝固。裂解。去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10% DMAO，1%Triton X-100），4裂解1h。裂解完毕后用预冷的PBS液，连续漂洗3次。电泳。在稳压15 V下，通过调节电泳槽液面高度使电流达到300 mA，在小于15温度下避光电泳20 min。染色。加5g/mL的溴化乙锭(EB)染液到胶体表面，避光染色1520 min，蒸馏水冲洗染色液，荧光显微镜镜检。3.3.3 结果与分析1、实验结果： HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5和P.f. AB92001在电泳操

39、作结束后，染色拍照结果如图3-5和3-6所示。图3-5 HYPERLINK /view/702098.htm t _blank E.coli.DH5的单细胞凝胶电泳图像图3-6 P.f. AB92001的单细胞凝胶电泳图像2、结果分析与讨论由于实验中菌液稀释的倍数过大，致使在电泳时看到的细胞很少，并且受到拍照像素的限制，菌体DNA的损伤结果表现不是很明显，但在图中可以看得到明显的亮团，这说明损伤的DNA确实在发生泳动。由于时间和技术的限制，在这里只能做一个现象的描述，无法对其进行定性定量的分析，希望以后的研究者能这方面做出更详细的研究。4微生物和重金属相互作用的应用范围及发展前景4.1 微生物

40、和重金属相互作用的应用范围4.1.1重金属污染的微生物学评价微生物法是环境介质污染毒性研究的一种常用方法，微生物常被应用于探讨污染物不同暴露强度下,对生态系统在个体、群体和系统水平的结构、功能的损伤。重金属污染物的生态毒性诊断指标体系的建立对环境监测有重要意义，但只有通过微生物毒性试验、遗传毒性试验(微核试验、致突变试验、代谢研究和DNA加合物研究等),才可部分地实现环境健康质量描述的指标量化,为环境重金属污染危害的预防及治理提供科学依据。Houba等认为一些细菌能在高浓度Cd污染环境中生长，其密度与环境毒性水平密切相关。张春桂等在研究高浓度重金属污染水域中微生物生态时指出，微生物的类群与重金

41、属的毒性对微生物富集重金属有很大影响。在研究土壤重金属对微生物的数量与群落效应时，发现重金属在低浓度下有促进作用，高浓度有抑制作用，并且不同类群的微生物敏感程度不同，通常是放线菌细菌真菌；另外，重金属可导致土壤中高等真菌种群下降，瑞典的Natural研究发现对照土壤中(Cu100mg/L)有35种真菌，而中等污染土壤中(1000mg/L)有25种，高度污染土壤中(10000mg/L)只有13种4.1.2 微生物在环境保护中的作用矿物工程等工业废物的微生物利用利用氧化亚铁硫杆菌(Tf)对金属硫化物的氧化作用来除去固体废物中的硫化物，降低固体废弃物对环境的污染。尽管小范围的微生物吸附方法治理矿区废

42、弃物已经使用，但迄今为止微生物吸附主要作为治理废水的方法而引起关注。为了减少甚至消除矿山废弃物造成的污染，从矿山废水中分离出来氧化铁硫杆菌和氧化硫杆菌等菌体，利用硫化矿物在细菌作用下浸出的机理，控制硫酸还原菌，抑制重金属的浸出来处理矿坑酸性废水。另一方面，有目的地利用微生物具有吸附或沉积各种离子于其表面的亲和力处理废水，加速金属的浸出，回收浸出液提取重金属。再者，利用微生物细胞和其它材料制成的生物制品来消除废水中有毒金属离子。重金属污染土壤的微生物修复技术微生物修复是土壤重金属污染的重要整治手段之一。与土壤有机污染物的微生物修复相比，关于土壤重金属污染的微生物修复研究和应用较少，仅在最近几年才

43、引起重视。重金属污染的微生物修复包含两方面的技术：生物吸附和生物氧化还原。前者是重金属被活的或死的生物体所吸附的过程；后者则是利用微生物改变重金属离子的氧化还原状态来降低环境和水体中的重金属水平。在有毒重金属离子中，以污染的微生物修复研究较多。在好气或厌气条件下，已知有许多微生物催化还原为的反应。许多研究还显示有机污染物如芳香族化合物可以作为还原的电子供体。这一结果表明微生物可同时修复有机物和的污染。微生物还可以通过产生还原性产物如和硫化物间接促进的还原。此外，重金属污染土壤的微生物修复另一重要方面就是菌根的使用。菌根是植物根系和真菌形成的一种共生体。菌根与土壤的交互作用形成菌根系，它是由有生

44、命的真菌、植物和非生命的土壤形成的微生态系统。对菌根系的研究表明，根系的环境状况直接影响重金属在土壤植物系统中的迁移和转化，而重金属形态与金属的迁移、转化和生物有效性有着密切的关系。微生物与菌根对重金属生物有效性的影响是多方面的，利用它们可提高植物提取修复的效率。4.2 重金属与微生物相互作用的发展前景通过以上研究基础，研究者可根据不同的侧重点，对重金属和微生物之间的相互作用及其应用作更深入地研究和探讨，以期待在以下几个方面的研究，从而进一步提高微生物在生活、生产中的利用价值，更好地发挥微生物“天然环境卫士”的作用：发现更多微生物物种，深入地了解它们的生长特性、结构特征及遗传特性，筛选出具有高

45、效专一吸附或降解重金属能力的微生物菌株。加强极端微生物的研究，例如海洋微生物的研究利用，充分发挥它们在环境保护中的作用。利用那些对重金属不太敏感的微生物作为重金属离子的吸附剂，并研究如何在废水浓度和化学组分不稳定情况下，维持微生物的吸附活性。加强土壤重金属污染对微生物的毒性效应研究，通过对周围环境介质的各种因素进行调节，充分发挥微生物的净化功能，同时也可将植物和微生物结合起来，实行生态修复。本实验中只就几种重金属离子对大肠杆菌，荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌的最小致死浓度有了确定，在以后可以系统地对庞大的微生物群体对各种重金属的抗性进行进一步研究探索。本实验中的三种细菌均属于带有鞭毛性细菌，根据有

46、鞭毛的细菌可以在半固体培养基中游动却又不能任意游走的现象，观察细菌生长情况，判断实验细菌是否有运动性。谢 辞即将结束四年大学的学习，我心中充满激动，同时也有点不舍，这四年的时间是我人生中十分重要的阶段。在这四年里，我学习了丰富的专业知识，为即将投入的实际工作奠定了坚定的基础，在学习的过程中，我学会了如何更好地发现问题、分析问题和解决问题，这在很大程度提高了我独立工作和动手的能力。回首这些成绩的同时，我衷心的感谢在这四年中曾在学习、工作和生活中给予我很多支持帮助和指导的老师、身边的同学们和我亲爱的室友们，我的这些成绩是和他们分不开的。首先，我要感谢我的论文指导老师梅运军老师，他指导我如何进行科学

47、实验，实验中要注意的问题，怎样处理实验数据，怎样写作论文等等。其次，我要感谢给我们实验提供仪器和帮助的应用微生物及生物技术实验室的刘军老师和赵沁学姐，同时我还要感谢和我同一实验室的同学们在实验过程中给我的帮助和关心，以及我们环境实验室王文清老师。最后衷心感谢各位老师对本论文的评阅和指正。参考文献1 王韬，李鑫钢，杜启云含重金属离子废水治理技术的研究进展J化工环保，2008，28(4)：323-326.2 Srivastava N K，Majumder C BNovel biofiltration methods for the treatment of heavy metals from in

48、dustrial wastewater JJournal of Hazardous Materials，2008，151(1)：183 Chander K，Brookes PCIsthe dehydrogenase assayinvalid as amethod to estimat microbial activity in copper contaminated soi_1Soil Biol Bio，1991，23(i0) 909-915.4 Gong L P(龚利萍)，Zhang J Y(张甲耀)，Luo Y X(罗宇煊)The status in quoandpros Dect of applying microorganisms to environment protectionChongqing Environ Sci(重庆环境科学)，2001，23(2)：7174.5 Todorow TS，Dimkov R，Koteva ZHEffect of lead contamination on the biological properties of alluvial meadow soilPochovoznanie Agrokhimiya，1987，22(5):33-40.6 陈素华，孙铁珩，周启星等微生物与重金属问的相互作用及其