对绿色荧光蛋白的了解及应用

1、对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号： 2011012923刖言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白 质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨 基酸，二级结构也是普通的a螺旋和。片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质 发出绿色荧光。【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸

2、收蓝光的部分能量，发出 绿色荧光。野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来1，它至少存在4种同源GFP， 但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生 色团位于氨基酸序列6469位的六肽内,6567位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价 键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构构成了 GFP生色 团的核心，见图1。图2为生色团的形成机制。图1多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列位的甘氨酸图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚

3、，大家只是认为，GFP是生物发光过程 中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签(protein tagging)利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利 用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达， 然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨 基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检 测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细

4、胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观 察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色 荧光蛋白进行标记。GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标 记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记 蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测 以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。2、药物筛选利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪，可以分离与纯化特 殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相

5、关蛋白质，来观察在单细胞内相互 作用的靶细胞，再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地 用于大规模筛选新的药物。另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛 选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选 中具有相当大的应用潜力。3、用于免疫学可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种 简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可 达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体 结合的背景干扰等

6、。线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大 量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发 射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免 疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一 6xHis 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分 子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来 的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞

7、细胞质中 成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染 色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞 筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。三、GFP的突变及其应用GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在 被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T)显著提高了 GFP的光谱性质，其荧 光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,这和常用的FITC滤光片匹配，提高了 GFP的

8、应用潜力。此外，GFP还存在其他的突变，如颜色突变。目前已经发现了蓝色荧光蛋白质 (EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama1 青色荧光蛋白质(ECFP, Cerulean,CyPet和黄色荧光蛋白质 (YFP,Citrine,Venus,Ypet等,它们可以使我们跟踪不同蛋白质的反应4。【结语】绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为一个具有独特光学性质的可编码基因 的生物分子，成为了寻找药物作用靶标和筛选新药的重要工具，被广泛运用于生物学和医学 研究等领域，为人类探究生命过程提供了十分宝贵的信息。参考文献1 Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends Biochem Sci,1995, 20 (11):448 -455薛启汉.江苏农业科学学报,1999,15 (1):52 -58Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends BiochemSci,1995, 20 (11