第三讲细胞相关生物学行为分析方法

1、第三讲细胞相关生物学行为分析方法一、细胞增殖动力学检测方法培养中，细胞的生长、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一个动态的过程，细胞增殖动力学是描述细胞状态的一项重要指标。(1)生长曲线(growth curve)的测定：记录细胞的绝对生长数值，了解细胞总体的(global)增殖生长规律。(2)分裂指数的测定：记录细胞群体中分裂期细胞(cell at mitotic phase)所占百分比，用以表示细胞增殖旺盛程度。(3)细胞增殖指数：新增殖(newly generated )的细胞占细胞总数的百分比。(4)集落（克隆）形成实验：测定单个细胞(single cell)增殖

2、能力。一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定对比生化、物理刺激、基因改造前、后细胞生长特性的差异反映细胞生长特性：对数生长期（传代）、倍增时间(doubling time)等在培养瓶或孔板中准确接种相同数量的细胞，每天计数(count everyday)，测出培养瓶或孔板中的细胞总数，持续7天（也可根据需要而定）。细胞接种量以7天能长满，而不发生接触抑制(contanct inhibition)为度。一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线(growth curve)的测定血球计数板Tips:(1)数上不数下，数左不数右；(2)每一大方格细胞数104=细胞数/mL(3)可用台盼蓝(

3、trypan blue)染色区分活、死细胞细胞计数法(cytometry)23一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定原理：活细胞线粒体(mitochondrion)中脱氢酶(dehydrogenase)能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶标仪(microplate reader)测定OD值即可获得间接的细胞数量表征。特点：快速，准确，可一次处理多个样品。由于脱氢酶非细胞数量的直接表征，常被审稿人诟病。类似方法：WST、MTS、XTT、CCK8

4、等。MTT（四唑盐）法酶标仪摇床96孔板一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定XTT法原理：XTT是异种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色(brown)甲肷产物，当XTT与电子耦合剂（PMS）共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。MTS法原理：与MTT法原理类似。MTS是MTT的类似物，能被活细胞线粒体中脱氢酶还原成可溶于水的有色产物甲臜盐，可直接进行比色。特点：步骤相对MTT更简单，相对更准确。WST-1法原理：与MTS原理类似。检测范围宽于MTT和MTS。CCK8法原理：基于WST-8。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢

5、酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。 一、细胞增殖动力学检测方法 (1)生长曲线的测定各种细胞增殖/毒性检测方法的优势比较一、细胞增殖动力学检测方法 (2)分裂指数(mitotic index)测定于细胞培养载玻片上进行，定时取出玻片进行固定染色，并观察计数，也可将数据绘制成曲线。细胞培养载玻片骨髓细胞Giemsa染色细胞分裂过程荧光染色一、细胞增殖动力学检测方法 (3)BrdU掺入法测定细胞增殖指数5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通过与胸腺嘧啶竞争掺入到S期细胞单链DNA中，再利用抗Br

6、dU单克隆抗体显示增殖细胞核。通常用DAPI和BrdU荧光染色复染的方法来分析细胞的增殖情况。BrdU competes with thymine in the synthesis of DNA during proliferation. Anti-BrduDAPIBrdU掺入法根据选择抗体标记物的不同，还可以通过免疫组化(IHC)、流式细胞术(FACS)、ELISA检测细胞的增殖情况。同类方法：EdU法一、细胞增殖动力学检测方法 (4)集落形成(colony forming)实验单个细胞在体外持续生长，其后代所形成的细胞群称为克隆或集落。该方法可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，也常用来确定抗

7、癌药物对肿瘤的杀伤能力。常用的方法包括平板集落形成实验（贴壁细胞）和软琼脂集落形成实验（悬浮细胞）。CFU-ECFU-GM一、细胞增殖动力学检测方法 (4)集落形成实验结晶紫染色Crystal violet二、细胞凋亡(apoptosis)检测技术细胞死亡有两种不同形式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是由外界因素导致的细胞急速死亡；凋亡是细胞在生理(physiological)或病理(pathological)条件下由基因(gene)调控的死亡过程。细胞凋亡过程中膜结构完整(integral membrane)，染色体DNA断裂(DNA fragmen

8、tation)，细胞膜包裹这核碎片形成凋亡小体(apoptosis body)。凋亡在胚胎发育、成年阶段衰老、病变细胞的清除发挥着重要的作用，也是研究药物作用机理和进行药物筛选的的重要手段。常用检测方法：1. 形态观察(morphology)2. DNA琼脂糖凝胶电泳(electrophoresis)3. MTT细胞活性检测4. 流式细胞仪分析(FACS)5. 原位末端标记（TUNEL）二、细胞凋亡检测技术 (1)形态观察可通过HE染色，Giemsa染色等方法观察凋亡细胞染色质浓缩，凋亡小体等现象，也可用电镜、荧光显微镜观察细胞凋亡。电镜观察细胞超微结构Hoechst33258染色细胞核观察凋

9、亡二、细胞凋亡检测技术 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳agarose electrophoresis细胞凋亡最突出的生化特征是由凋亡引起的核酸内切酶(endonuclease)的活化，使染色质核小体(nucleosome)间连接断裂，DNA裂解为长度为180200bp及其倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现DNA梯形电泳图谱。二、细胞凋亡检测技术 (3)凋亡细胞原位末端标记法（TUNEL）凋亡细胞染色体DNA的断裂首先降解为50300kb的大片段，然后在核小体间随机断开，形成180200bp的小片段。脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）的作用下，生物素或荧光素标记的dUTP可以掺入到凋亡细胞双链或单链D

10、NA的3-OH端，通过颜色反应，特异准确的定位凋亡细胞。优点：是分子生物学和形态学相结合的方法，并可检测出早期和极少量的凋亡细胞，灵敏度比DNA Ladder法高。二、细胞凋亡检测技术 (4)流式细胞仪检测凋亡（PI单染色）溴化丙锭（propidium iodide, PI）可与细胞内DNA结合，流式细胞术检测到的PI荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。凋亡细胞由于总DNA量降低，将于正常G1/G0期细胞群前出现一亚二倍峰，即凋亡细胞群。G1/G0期：正常细胞（2N）；G2/M期：分裂的细胞（4N）；S期：细胞DNA含量介于前两者之间。缺点：无法区分死细胞与凋亡细胞，对早期凋亡也无法检测

11、。二、细胞凋亡检测技术 (4)流式细胞仪检测凋亡（AnnexinV-PI双染色）磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）分布于细胞内膜，凋亡细胞PS外翻。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。三、细胞迁移/侵袭检测技术细胞迁移（migration）和侵袭（invasion）的概念最初来自于肿瘤学。侵袭是指恶性肿瘤细胞从起源部位沿组织间隙向周围组织浸润的过程，其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤侵袭是肿瘤细胞与周围间质相互作用的结果。细胞侵袭的研究侧重于细胞与胞外基质（ECM）的相互作用。三、细胞迁移(migration)/侵袭(invasion)检测技术细胞

12、迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后产生的移动。过程中细胞不断向前方伸出突足(pseudopodium)，然后牵拉胞体的循环过程。细胞骨架(cytoskeleton)和其结合蛋白(binding proteins)是这一过程的物质基础，另外还有多种物质对之进行精密调节。细胞迁移侧重于研究细胞的趋化性(chemotaxis)和运动性(motility)。三、细胞迁移/侵袭检测技术 (1)Transwell 法检测细胞迁移Transwell chamber也叫做通透性细胞培养支持物，孔径的膜主要应用于药物转导研究，细胞迁移、侵袭、趋化性和运动性研究通常采用以上孔径的膜。一般迁移

13、/侵袭实验使用8m直径的膜。实验结束后采用结晶紫(crystalviolet)或DAPI等染色观察迁移细胞数目。 control 0.1 g/ml 0.5 g/ml 1 .0 g/ml OPN 三、细胞迁移/侵袭检测技术 (2)划线法检测细胞迁移划线法又叫做wound healing法，是体外模拟体内伤痕愈合过程的实验方法。三、细胞迁移/侵袭检测技术 (3)Transwell法检测细胞侵袭基底膜(basementmembrane)是普遍存在的一种连续的细胞外基质成份构成的膜性结构，主要含层粘连蛋白(laminin)和胶原(collagen)。局部蛋白质水解导致基底膜降解有利于肿瘤细胞的穿出。常

14、用的人工基底膜材料为Matrigel。三、细胞迁移/侵袭检测技术 (4)微流控法检测细胞迁移、侵袭VEGF诱导内皮细胞迁移Migrating cells into soft (pH 7.4) and rigid (pH. 11.0) scaffolds were studied.Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue).共培养条件诱导内皮细胞迁移MTLn3： GFP-expressing rat mammary adenocarcinoma cells (乳腺癌

15、细胞)U87MG： GFP-expressing human glioblastoma cell line （胶质瘤细胞）10T ： Mouse smooth muscle precursor cells （平滑肌祖细胞）Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue).HMVEC （内皮细胞）were stained for vWF(green) to distinguish them from 10T 1/2.四、细胞生物力学特性检测技术 (1)微管吸吮技术(Mic

16、ropipette Aspiration Technique, MAT)原理：采用微管吸吮方法捕获表征特异性相互作用分子的细胞或小球，通过压电晶体驱动器操控微管，实现两细胞或小球间靠近-接触-回拉的动力学循环，并记录回拉过程中细胞变形与否、变形大小和解离时间长短等信息来研究分子间相互作用(interaction between molecules)的动力学性质。优点:可直观观察粘附事件的发生(directly observe the adhesion events)，而且每次粘附事件均可控。局限性:在于通量低、每次只能实现单一细胞对检测，且由于测试周期较长、体外难以长时间维持细胞功能状态的限制

17、，难于获得大样本的统计数据。Long M, 2007, JBC, Two-dimensional Kinetics of P-selectin-PSGL-1 Interactions四、细胞生物力学特性检测技术 (1)微管吸吮技术四、细胞生物力学特性检测技术 (2)光镊技术(optical tweezers)光是一种特殊的物质，携带有能量和动量，光与物质相互作用时彼此交换能量和动量，产生各种效应。捕获微小粒子的光镊是一个特别的光场，这个光场与物体相互作用时，物体整个受到光的作用从而达到被钳的效果，然后可以通过移动光束来实现迁移物体的目的。光镊可以捕获和操控几十纳米到几十微米大小的粒子(opti

18、cal tweezer can capture particles with diameters of dozens of nanometer/micrometer )，它还可以作为微小力的探针，测量皮牛亚皮牛量级的力，正好可以用来研究生物细胞的力学行为，以及细胞与生物大分子如蛋白质等的相互作用等，进而从单细胞、单分子层次上揭示细胞生命活动的基本规律。四、细胞生物力学特性检测技术 (2)光镊技术细胞水平上：1. 操控细胞，高选择性分选细胞和细胞器；2. 诱导细胞产生形变，研究细胞应变能力；3. 研究细胞弹性；利用光镊移动2微米的粒子利用光镊移动红细胞（视频）利用光镊研究红细胞张力分子水平上：1

19、. 操控生物大分子，如DNA的扭转打结，可使DNA分子比肌动蛋白还强壮，用于缝合细胞和神经的细微手术；2. 研究单分子力学特性，如DNA折叠动力学，蛋白运动特性等；四、细胞生物力学特性检测技术 (2)光镊技术利用光镊对DNA打结（knot）利用光镊研究动力蛋白的运动四、细胞生物力学特性检测技术 (3)原子力显微镜(atomic force microscope ,AFM)原子力显微镜是一种可用来研究固体材料表面结构(surface structure of materials)的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。Phase contrast image (top left), Fluorescence image (bottom left), AFM height image (top right, scan range 0 - 3.2 m) and AFM