分子生物学复习PPT课件

1、分子生物学复习一、主要专业术语组蛋白：真核细胞染色体结构蛋白，2M NaCl能使之与DNA分开，包括：H1,H2A,H2B,H3,H4。C值（C-value):一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象（C-value paradox): 真核生物含有大量不编码蛋白的重复序列，高等生物的C-值一般大于低等生物，且随着生物的进化而增加。但两栖类动物的C- 值比哺乳动物的还大，并且两栖类动物的C-值相差也比较大，甚至相差100倍，这种现象为C值反常现象。卫星DNA（satellite DNA): 真核生物染色体中的一些高度重复序列，通常位于染色体的着丝粒部位，也有一些存在于染色体臂上，当该生物

2、的总DNA进行电泳时，这些DNA出现在主带以外的卫星区带内，卫星DNA不转录，是异染色质成分，与染色体的稳定性有关。 小卫星DNA(mimisatellite DNA): 又称可变串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR)，10数百个bp，由于存在重复单位的不平衡交换，产生不同等位基因，通过杂交可以检测，是多态性的一种。微卫星DNA(micro-satellite DNA)：重复单位序列最短，只有26bp，串联成簇，长度50100bp，又称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat ，STR)。广泛分布于基因组中。 富含A-T碱基

3、对。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP):单个核苷酸引起的DNA多态性。串联重复序列的多态性（tandem repeats polymorphism): 由重复序列增减引起的DNA多态性。端粒（telomere):真核生物线性基因组末端的一种特殊结构，是DNA和蛋白质组成的复合体，其中的DNA多为高度重复序列，能稳定染色体DNA，决定细胞寿命。 DNA半保留复制（Semiconservative replication): DNA在复制过程中，两条链间的氢键断裂，两条链分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的双链，这样新合成的两个DNA与

4、原DNA分子的碱基序列完全相同，每个子代DNA中的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的。复制子（replicon):DNA的复制单位，从复制起点到复制终点的一段DNA。D-环型（D-loop): 先在动物线粒体DNA复制时被发现。这种复制两链合成高度不对称，一条链迅速指导互补链的合成，另一条链则游离出成单环（D-环）。半不连续复制（DNA semidiscontinuous replication)： 从DNA的复制过程来看，一条新链的合成是连续的，另外的一条链的合成是先合成一些短的冈崎片段，再连接成连续的新链，因此这种复制方式为半不连续复制。 错配修复恢复错配的碱基切除修复（碱基切除修复

5、、核苷酸切除修复）切除突变的碱基或核苷酸，恢复破坏的DNA重组修复受损DNA先不复制，而是由其等位基因复制一段后替代受损DNA.DNA直接修复酶催化修复嘧啶二聚体或甲基化DNASOS修复系统DNA损伤后产生过多单链引起的修复DNA转座（transposition): 由可移位因子介导的遗传物质的重排现象。转座子（transposon, Tn):存在于染色体DNA上可自主复制和转移的基本单位。插入序列（insertional sequence,IS)：不含任何宿主基因的转座子，当其插入特定基因中造成该基因突变。复合式转座子（composite transposon):带有抗药性基因或其它宿主基因

6、的转座子，其两侧带有两个相同或高度同源的IS序列。当两个IS插入某个功能基因两侧时就产生了复合式转座子，IS就不能单独移动。P转座子（P element): 果蝇中的一种转座子,插入基因组中的w位点能引起杂交后代的不育。P转座子两侧有31bp的倒置重复序列，插入靶位点还产生8bp的正向重复序列。P转座子含4个外显子和3个内含子。启动子（promoter): 位于基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与DNA模板结合，引起转录的开始。识别后，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡，核苷酸与模板 DNA配对。终止子（Terminator):位于基因3下游的一端DNA，当转录进行到该区域时

7、，RNA聚合酶与模板分离，RNA链释放，转录终止。转录单元（transcrition unit): 从启动子开始到终止子结束的一段DNA序列。RNAP从转录起点开始转录，沿模板前进到终止子结束转录出一条RNA链。转录起点：与新生RNA链第一个核苷酸相对应模板链上的碱基，通常是嘌呤。下降突变（down mutation)：启动子内的某个碱基突变导致其启动转录效率降低的现象。上升突变（up mutation):启动子内的某个碱基突变导致其启动转录效率提高的现象。增强子（enhancer）:位于启动子以外的DNA序列，能增强或促进转录的开始，且其增强活性不以其位置的改变而改变，可能促进了RNAP与D

8、NA的相互作用而促进了转录。抗终止（antitermination):转录过程中即使遇到终止信号，转录仍然继续进行的现象。RNA剪接（RNA splicing): 从RNA前体分子中去除被称为内含子（intron)的非编码区，连接被称为外显子（exon)的编码区，使之成为成熟RNA分子的过程。核不均一RNA（hnRNA, heterogeneous nuclear RNA): 真核基因的原始转录产物，即mRNA前体。内含子变位剪接： 高等生物中，内含子通常是有序或组成性地从hnRNA中被切除。然而在个体发育或细胞分化的特定时期，可以选择性地越过某些外显子或剪接位点进行剪接，产生组织或发育特定阶

9、段的mRNA。RNA编辑（RNA editing): RNA特别是 mRNA的一种加工形式，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因为RNA的序列经过编辑发生改变。 SD序列（Shine-Dalgarno sequence),或核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS)：原核生物mRNA起始密码子前含有7-12个核苷酸的保守区，与核糖体小亚基中16S rRNA的3端互补，在mRNA-核糖体结合过程中起作用核酶（ribozyme): 一类具有催化功能的RNA分子，通过催化RNA链中的靶位点中磷酸二酯键的断裂，特异性的剪接RNA 分子。分为：剪切型核酶和剪接型核酶密码子

10、（codon):存在于mRNA中的三个相邻的核苷酸顺序，是蛋白质合成中某一特定Aa的密码单位，密码子确定哪一个Aa掺入多肽链上的哪个位置。移码突变（frameshift mutation):基因中插入或缺失若干核苷酸，转录后以突变的mRNA为模板合成蛋白质时，会改变突变密码子以后的全部Aa序列。密码子兼并性（codon degeneracy): 由一种以上的密码子编码同一Aa的现象。同义密码子（synonymous codon):对应同一Aa的不同密码子。如GGG, GGA, GGC, GGU 一般而言，某Aa的同义密码子越多，则该Aa在蛋白质中出现的频率也越高。同工tRNA（isoaccep

11、tor tRNA ）：携带同一Aa的不同tRNA。同工tRNA结构相似。无义突变：基因内部一个核苷酸的突变，使编码Aa的密码子突变成了终止密码子，使蛋白质合成提前终止，合成出无功能或无意义的多肽。错义突变：基因内部一个核苷酸的突变，使编码Aa的密码子突变成了编码另外一个Aa的密码子。分子伴侣（molecular chaperone):很多新合成的多肽折叠成有功能蛋白时，必需有其它蛋白分子的参与才能完成，但这些蛋白并不是折叠蛋白的一部分，这些帮助其它蛋白折叠的蛋白分子就是分子伴侣。泛素（ubiquitin)：真核细胞中存在的由76Aa组成的蛋白，高度保守，它通过结合在其它蛋白上，从而改变这些蛋白

12、的功能，引导蛋白进入蛋白酶体而降解。Klenow fragment: DNA聚合酶I经枯草芽孢杆菌蛋白酶(subtilisin)切割产生的大片段,具有DNA聚合酶和3 5 外切酶的活性,缺少5 3 外切酶的活性。感受态细胞（competent cell):经过物理、化学方法处理而易于获取外源DNA的细胞。核酸分子杂交（Hybridization of nucleic acids）:带有互补序列的单链DNA或RNA混合在一起退火时，其相应的同源区段会形成双链的过程。杂交分子（Hybrid molecular）:不同来源的单链DNA或RNA分子退火形成的双链分子。Southern blot(DNA

13、 印迹）：酶切的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分离，碱变性后转移到固相支持物（NC膜）上，用标记的探针检出目的片段所在位置的方法。发明人： Edwin Southern(英）Northern blottting(RNA印迹)：不同分子量的RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离，转移到固相支持物上，用特异探针检出目的RNA所在位置的方法。Western Blotting(蛋白质印迹,免疫印迹): 不同分子量的蛋白质经SDS分离，转移到固相支持物上，用特异的抗体检出目的蛋白所在位置的方法。South-western blotting: 蛋白质经过PAGE分离并转移到固相支持物上，用标记的双链DNA检出DN

14、A结合蛋白的方法。North-western blotting: 蛋白质经过PAGE分离并转移到固相支持物上，用标记的RNA检出RNA结合蛋白的方法。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)：体外利用DNA快速扩增特定基因或DNA序列的方法。若干循环，每一个循环包括：变性、退火、延伸三个阶段。同义cSNP (synonymous cSNP): SNP导致的编码序列改变不影响其所翻译蛋白的氨基酸序列,突变碱基与非突变碱基的含义相同.非同义cSNP (non-synonymous cSNP): SNP导致的编码序列改变导致翻译出蛋白质的氨基酸序列发生改变,从而导

15、致性状的改变.单倍型（haplotype）:位于某一等位基因内部的多个SNP的总和。基因分型( genotyping): 利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究技术,包括基因芯片技术,Taqman技术,分子信标(molecular beacon)技术和焦磷酸测序技术(pyrosequencing)等.基因敲除（gene knock-out): 又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，使基因失活，从而确定基因与性状的关系，具有专一性强，染色体DNA与外源DNA共同稳定遗传等特点。T-DNA（transfer DNA):位于Ti质粒

16、上的一段DNA序列，该DNA进入植物细胞后，可整合到植物基因组DNA中,插入是随机的。RACE(rapid amplification of cDNA ends):在已知部分cDNA序列的基础上，通过PCR扩增cDNA 3或5端未知序列的技术。分为5RACE和3RACE。cDNA差示分析法（representional difference analysis ,RDA):利用不同细胞来源的cDNA杂交，通过改变接头和PCR技术扩增目的cDNA的片段。基因图位克隆法（map-based cloning）:根据基因连锁图，确定决定某种表现型基因的方法。RFLP(Restriction fragme

17、nt length polymorphism, 限制性片段长度多态性)：生物个体之间DNA的序列存在差异，称为DNA多态性。由于DNA序列的改变导致了DNA分子上限制性内切酶的酶切位点发生改变，从而导致了相应限制性酶切片段的长度和数量发生变化。RAPD(Random amplification polymorphic DNA, 随机扩增多态性DNA): 利用随机引物，通过PCR从基因组中扩增不同长度的DNA片段的技术。染色体步移（chromsome walking):长链DNA用核酸内切酶进行部分切割，获得系列片段，克隆进载体，由于片段之间存在重叠，可用一个片段作为探针，检出其它片段，经过测序

18、后，可以把这些片段拼凑成一个连续的序列。基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression, SAGE):以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能直接读出任何一种类型（细胞或组织）的基因表达信息。原位杂交（in situ hybridization, ISH）: 用标记的核酸探针在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一种手段。分为RNA原位杂交和染色体原位杂交.荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）:是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光素标记的核酸探针通

19、过原位杂交，只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位。定点突变（site-directed mutagenesis）:通过改变基因内部特定位点的核苷酸序列（1数个）来改变所编码蛋白的氨基酸序列，通常用于研究某些氨基酸残基对蛋白的结构、催化活性及配体结合能力的影响，也可用于改变DNA的调控序列、或引入新的酶切位点等。RNA干扰（ RNA interference, RNAi ）:利用双链小分子RNA高效特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型的技术。DNA芯片（DNA Chip）：又称为DNA微列阵技术（DNA microassay），将大量

20、已知或未知序列的DNA单链片段点在一张很小的玻璃片或尼龙膜上，通过物理吸附实现固定化，将芯片与待研究的cDNA(荧光素标记）杂交，经过扫描和数据处理，可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期的表达情况。蛋白质组学（Proteomics): 研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱，以研究特定基因表达情况的科学。基因组学（Genomics): 研究某一物种全部基因的科学，对某一物种而言，基因组是固定的，而蛋白质是不定的。噬菌体展示（Phage display）:将目的基因插入噬菌体基因组，使之与噬菌体外壳蛋白基因融合，经包装后亲染宿主细胞，产

21、生子代噬菌体外壳上带有目的基因编码的蛋白。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 Far Western blotting：一种基于Western blotting的一种分子生物学方法。在Western blotting中用抗体作为探针来检测目标蛋白，而在Far Western blotting中用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质作为探针。因此，Western blotting用来检测特定的蛋白而Far Western blotting则用于检测蛋白

22、质之间的相互作用 。组成型表达（constitutive expression）：组成细胞的基因有些能够连续指导蛋白质的合成。适应型表达（adaptive expression)：有些基因只在特定环境条件或发育特定阶段下才能指导蛋白质的合成魔斑（magic spot）核甘酸：基因型为rel+ 的大肠杆菌缺乏氨基酸大量合成鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）。弱化子（attenuator）:位于结构基因上游的一段DNA，该DNA的转录产物可形成茎环结构控制转录的进行，使转录继续或停止，这种调节受代谢物的调控。弱化作用（attenuation）:由弱化子介导的转录提前终止的转录控制

23、机制。 基因家族（gene family ）:真核细胞中许多功能相关的基因成套组合，组成一个基因家族。断裂基因（interrupted gene）:大多数的真核基因编码氨基酸的序列为不编码氨基酸的内含子所隔开。DNaseI超敏位点（ DNaseI hypersensitive site）: 活跃表达的基因所在染色体上存在一个或数个对DNaseI敏感的位点。CpG岛（ CpG island）： CpG中的C通常发生甲基化修饰，且易脱氨基形成T，所以细胞中CG联在一起出现的频率要远低于其它两个碱基出现在一起的频率，细胞中的 CpG通常成串出现在DNA中，称为CpG岛。顺式作用元件（cis-acti

24、ng element）：真核生物的启动子、增强子等是由若干DNA序列构成，它们常与特定的功能基因连锁在一起，对基因转录具有重要调控作用，从而影响基因表达，这样的DNA序列称为顺式作用元件。反式作用因子（Trans-acting factor）：直接或间接结合在各类顺式作用元件上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质。核心启动子元件（core promoter）:-25-30区的TATA box上游启动子元件（UPE）:-70-80的CAAT box,-80-110的Gcbox, 通过与TF作用，调节转录的起始频率。cAMP应答元件（cAMP response element, CRE）: cAMP激

25、活PKA，PKA又通过使许多转录因子磷酸化而激活其转录活性，这些转录因子结合在调控基因5端的序列被称为cAMP应答钙调蛋白（calmodulin）:生物体广泛存在的一种钙结合蛋白，该蛋白通过结合调节多种蛋白从而影响细胞功能。应答元件（response element）:与某个专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列，是顺式作用元件的一种。如热激应答元件（heat shock response element, HSE），金属应答元件（metal response element） 原癌基因（proto-oncogene）：基因组中某些基因在正常细胞中不表达，只有癌细胞中才表达，与

26、细胞癌变密切相关，这类基因为原癌基因。原病毒（provirus）：某些病毒基因组为单链RNA，感染动物细胞后，利用其基因组中的pol基因编码的反转录酶合成与基因组互补的DNA，再利用宿主的DNA聚合酶合成第二链，成为双链DNA，并整合到宿主基因组中，这样的DNA为原病毒。基因领域（gene territory）:同一条染色体上基因与基因之间的距离。基因领域效应（gene territorial effect）:染色体上同一方向的两个基因小于一定距离时，会降低其转录活性。抑癌基因：细胞染色体上存在的抑制细胞恶性增殖的一些基因。HIV：艾滋病病毒粒子是一种直径约为100nm的球状病毒，包被着由两层

27、脂质组成的脂膜，这种结合有许多糖蛋白分子（主要是gp41和gp120）的脂质源于寄主细胞的外膜。蛋白质p24和p17组成其核心，内有基因组RNA链，链上附着有反转录酶。HBV：乙肝病毒完整粒子的直径为42nm，又称为Dane颗粒，由外膜和核壳组成，有很强的感染性。其外膜由病毒的表面抗原、多糖和脂质构成；核壳直径27nm，由病毒的核心抗原组成，并含有病毒的基因组DNA、反转录酶和DNA结合蛋白等。AIV：属于正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒。病毒颗粒直径80-120nm，平均100nm，呈球形，基因组为多个RNA.SARS-CoV：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒，SARS-CoV直径80-1

28、60nm,有囊膜，表面有纤突（Spike）,排列呈皇冠状。囊膜由脂质双分子层组成，上有纤突蛋白S(E2)、血凝素脂酶HE(E3)、膜蛋白M(E1)和小包膜蛋白E。病毒核心是核衣壳蛋白N以及基因组+RNA。 基因治疗的in vivo途径: 将外源基因(治疗基因)装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA，有利于大规模工业化生产。基因治疗的ex vivo途径：将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）被“基因工程化的”细胞，经体外细胞扩增后输回人体。等位基因排斥（allelic exclusion）：因为一条染色体上的基因表达而抑制另一条

29、染色体上相同基因表达的现象。同型排斥（isotypic exclusion）：B淋巴细胞的轻链表达时，只生成一种链（链或是链），不可能同时表达链和链。遗传图（Genetic Map）: 又称连锁图（Linkage Map），是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离，通常以基因或DNA片段在染色体交换过程中的分离频率厘摩（cM）来表示。cM值越大，两者之间距离越远。LINEs（long interspersed elements）: 人类自主复制型转座子，可能是人类基因组中最古老的重复序列，一般长5-6 kb，含有RNA聚合酶II启动子序列和两个可读框.SINEs（short inte

30、rspersed elements）是非自主转座子，长约100400 bp，其3末端与LINEs有同源性，因此能依靠LINEs进行转座。物理图（Physical Map）：以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site，STS）为“路标”，以碱基对（bp，kb，mb）作为基本测量单位（图距）的基因组图。转录图（Expression Profiling）：基因转录图（cDNA图），或者基因的cDNA片段图，即表达序列标签图（EST，expressed sequence tag），以基因的外显子序列或表达序列标签为标记，精确地表明这些标记在基因组或染色体上位置

31、的物理图。酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）：利用酵母着丝粒载体所构建的大片段DNA克隆载体。克隆载体上含有着丝粒、端粒、可选择标志基因、自主复制等序列，可携带插入的大片段DNA(1001000 kb)在酵母细胞中有效地复制，如同微小的人工染色体。是基因组研究的有用工具。细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome， BAC）：在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的大片段DNA克隆载体。克隆能力在125150 kb左右，具有载体复制、拷贝数控制相关的序列及筛选标记。 假基因(pseudogene):具有与功能基因相似

32、的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以假基因是没有功能的基因，常用表示。二、主要的知识点组蛋白特性： a、进化上的极端保守性 不同生物组蛋白组成及一级结构十分相似，特别是H3和H4。如：牛、猪、鼠的H4的氨基酸序列完全相同，而牛和豌豆的H4只差2个Aa。 b、无组织特异性 一个生物所有组织的组蛋白都相同。例外：鱼类、鸟类和两栖类动物红细胞染色体不含H1，而含H5，精细胞中的组蛋白是鱼精蛋白。 c、肽链上Aa分布的不对称性 碱性氨基酸分布在N-端，而疏水氨基酸分布在C-端。作用： N-端通过离子键与带负电荷DNA结合， C-端通过疏水相互作用与其它蛋白结合。 d、组蛋白的修饰作用 H

33、3,H4易发生甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰，与基因表达的调控有关。e、富含Lys的H5 具有种属特异性，H5的磷酸化与染色体失活有关。染色质中DNA与组蛋白结合在一起的证据 染色质中的DNA的Tm比游离的DNA的Tm高. 在染色质状态下，其DNA作为模板在DNA聚合酶、RNA聚合酶催化下的复制和转录活性大大低于游离DNA。 DNase I对染色质DNA的降解速度远远低于对游离DNA的降解速度。真核生物基因组的结构特点真核生物的基因组远大于原核生物的基因组 。存在大量的重复序列真核基因组中的DNA大部分为非编码序列，可达90%以上。真核基因的转录产物多数是单顺反子mRNA。真核生物的基因多数是断

34、裂基因，有内含子。真核基因中存在大量顺式作用元件。真核基因组存在大量DNA多态性（DNA polymorphism） 真核基因组（染色体）具有端粒结构DNA的类型 B-DNA:相对湿度为92%，右手螺旋。 A-DNA:相对湿度小于75%，右手螺旋，螺体宽而短，RNA-DNA杂交分子。 Z-DNA：Rich, CGCGCG寡聚体，左手螺旋 环状DNA：线粒体DNA,叶绿体DNA，病毒DNA，质粒DNA等。原核生物DNA聚合酶的作用DNA polymerase I:去除RNA引物，补平缺口，其5 3外切酶活性可切除UV引起的嘧啶二聚体。 DNA polymerase I用枯草芽孢杆菌蛋白酶切割得到

35、了一个大片段(Klenow 片段）具有DNA聚合酶活性和3 5外切酶活性，小片段具有5 3外切酶活性。DNA polymerase II： 3 5外切酶活性起校正作用，可以修复DNA.DNA polymerase III：单体包括9个亚基，活性形式是其二聚体，是DNA复制过程的主要催化酶。此外，还发现了DNA聚合酶IV和DNA聚合酶V，参与DNA的修复。真核生物与原核生物DNA复制的差异（1）原核DNA通常具有一个ori，而真核生物染色体具有很多ori。（2）原核生物DNA上的ori，在一个复制过程尚未完成时，新的复制叉有 又在ori处形成；真核生物在一条染色体完成全部复制之前，各ori不再进

36、行复制。（3）真核生物DNA复制子称为ARS(autonomous replicating sequence),长约150bp，含复制起始必需的保守区，并需要起始原点复合物（ORC)的参与。（4）真核生物DNA复制速度慢，不到E.coli的1/20。（5）真核生物的DNA聚合酶与原核生物的不同。E.coli中的主要是DNA聚合酶I, II,III;而真核生物的DNA聚合酶包括：DNA聚合酶，和。 IS的特征： a、较小，约1kb b、末端具有倒置重复序列 c、转座时复制靶位点的一段DNA(4-15bp)，插入靶位点形成两端的正向重复序列。 d、除了IS1外，已知IS都只含有一个开放读框，通读则

37、产生转座酶。原核生物的RNA聚合酶各亚基功能：核心酶组装，启动子识别， ：组成RNA聚合酶的催化中心：功能不详：不同识别不同启动子 真核生物的RNA聚合酶 根据RNA聚合酶的转录产物及对 鹅膏蕈碱的敏感性不同，真核生物的RNA聚合酶分为三类：RNA聚合酶I， RNA聚合酶II和RNA聚合酶III。聚合酶细胞定位转录产物相对活性对鹅膏蕈碱RNAP I核仁rRNA50-70%不敏感RNAP II核质hnRNA20-40%敏感RNAP III核质tRNA10%物种特异原核生物启动子结构特点 -10区，TATA(A)， TATA box(Pribnow box) -35区，TTGACA -10区、 -

38、35区是RNA聚合酶与启动子结合位点，与因子有很高的亲和力。真核生物启动子结构特点 -25-30区， TATAAA， TATA box(Hogness box) -70-80区， CCAAT, CAAT box -80-110区， 富含GC， GC box原核生物与真核生物启动子结构的差异1、原核生物的启动子小，结构简单，除-10区的TATA box,-35区的TTGACA，-30-70区为正调控因子结合序列，+1-20区为负调控因子结合序列。2、真核生物启动子较大，结构复杂，除-25-30区的TATA box,-70-80区的CAAT box外，大多数启动子还含有GC box。3、真核生物的

39、TATA box与UAS的作用不同，TATA box决定转录的起始，而UAS决定转录的起始频率。4、真核生物启动子并不都含有TATA box, CAT box, GC box，缺一或缺二的启动子，其转录调控由调控因子（蛋白）来完成。原核生物与真核生物mRNA的特征比较1、原核生物边转录边翻译，真核生物mRNA的转录和翻译在时空上是分开。2、原核生物的mRNA以AUG(或GUG,UUG)为起始密码子，而真核生物的mRNA几乎都以AUG为起始密码子。3、原核生物mRNA半寿期短，只几分钟，而真核生物mRNA的半寿期则长的多。4、许多原核生物的mRNA以多顺反子的形式存在，而真核生物成熟的mRNA绝

40、大多数是单顺反子mRNA.5、原核生物mRNA 5端无帽子结构，3端没有或只含很短poly(A）尾，真核生物的mRNA（线粒体、叶绿体mRNA除外）一般mRNA5端具有帽子结构，3端有长的poly(A）尾。6、原核生物mRNA起始密码子前含有7-12个核苷酸的保守区，与核糖体小亚基中16S rRNA的3端互补，在mRNA-核糖体结合过程中起作用，称为SD序列（Shine-Dalgarno sequence),或核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS), 真核mRNA无该结构。RNA修饰 有些RNA，特别是rRNA和tRNA，会发生特异的化学修饰。（1）甲基化，m7

41、G （2）脱氨基，G I, C U（3）硫代，S取代碱基中的O，U 4-硫尿嘧啶（4）同分异构化，碱基发生了替代， C 密码子与反密码子识别的摆动学说（wobble hypothesis): 密码子与反密码子的配对中，前二者(密码子的第1位和第二位）严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定自由度，可以摆动，使某些tRNA可以识别一个以上密码子。 反密码子第1位是A或C,只识别一种密码子，即：A-U,C-G。反密码子第1位是G或U,可识别两种密码子，即G/C,U; U/A,G。反密码子第1位是I,可识别三种密码子，即：I/A,U,C。肽链的延伸 包括Aa-tRNA与核糖体A部位结合 肽键形成 核糖

42、体移位1、 Aa-tRNA与核糖体A部位结合 第二个Aa-tRNA在延伸因子EF-Tu和GTP的作用下，形成Aa-tRNA.EF-Tu.GTP复合物进入A位点，GTP 水解，释放EF-Tu.GDP+Pi。2、肽键的生成 在肽基转移酶（peptidyl transferase)作用下，位于A部位的Aa-tRNA与位于P部位的fMet-tRNAfMet 上的两个Aa之间形成肽键。具体过程： A部位的Aa-tRNA上游离的-NH2 亲核攻击 P部位fMet-tRNAfMet 的酯键（fMet-COO-ACC-tRNA), fMet与tRNA分开，而与游离的-NH2 形成肽键， tRNAfMet游离出

43、。3、移位 核糖体沿mRNA 5 3方向移动一个密码子， tRNAfMet从P部位移到E部位，二肽酰-tRNA从A部位移到P部位，空出A部位接受下一个Aa-tRNA。移位需要移位因子EF-G,并由GTP水解供能。每合成一个肽键需要2分子GTP。原核生物肽链延伸需EF-Tu,EF-Ts,EF-G; 真核生物需要EF-1,EF-2。肽链的终止 当A部位出现终止密码子（UAA,UAG,UGA)时，无Aa-tRNA与之结合，释放因子（RF)识别这些密码子并与之结合，水解多肽链与tRNA间的酯键，释放多肽链和tRNA，大小亚基解体，蛋白合成结束。原核生物释放因子有RF1,RF2,RF3。真核生物只有一种

44、释放因子RF. RF1识别UAA,UAG; RF2识别UAA,UGA RF3与核糖体解体有关， RF3具有GTPase, 水解GTP使肽链与核糖体分开。蛋白质前体的加工 1、N-末端fMet, Met的切除 甲酰基(f)被脱甲酰化酶水解 Met也常被切除。2、二硫键的形成 氧化作用使两个-SH形成-S-S-3、特定氨基酸的修饰（1）磷酸化：Kinase使含羟基的Aa加上磷酸基团（2）糖基化：Asp,Ser,Thr,Asn等侧链上加上糖基。（3）甲基化。（ 4）乙基化（5）羟基化：Pro, Lys侧链。（6）羧基化4、非功能片段的切除 信号肽和非活性Aa的去除。蛋白合成的抑制剂 多数常见抗生素是

45、蛋白合成抑制剂，抗感染。 氯霉素（chloramphenicol)：阻止mRNA与核糖体的结合 四环素(tetracycline)：阻止Aa-tRNA与核糖体的结合 链霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)：干扰Aa-tRNA结合而产生错读，如使编码Phe的密码子UUU翻译成Ile嘌呤霉素（puromycin):提前释放肽链抑制蛋白合成。它是Aa-tRNA的类似物，进入核糖体A部位，与肽酰-tRNA反应，多肽链的C-末端连接嘌呤霉素。 可抑制原、真核生物的蛋白质合成。可作为抗肿瘤药物，抑制肿瘤细胞蛋白合成。信号肽假说（signal pept

46、ide hypothesis) 信号肽（signal peptide）： 某些新合成蛋白的N-末端含有的13-36Aa组成的氨基酸序列，与该蛋白的跨膜运输有关，具有以下特点（1）10-15个疏水Aa；（2）靠近信号肽N-末端带有1个或数个带正电荷的Aa；（3） C-末端靠近蛋白酶切割位点处带有数个极性Aa,离切点最近的Aa往往是带有短侧链的Gly或Ala。线粒体蛋白的跨膜运转1、进入线粒体蛋白质多以前体形式存在，其N-末端带有一段前导肽（leader peptide)长约20-80Aa，当前体蛋白过膜时，前导肽为多肽酶水解，释放成熟蛋白2、蛋白质通过线粒体内膜的运输是一种需能的过程3、蛋白质过

47、膜运输时，首先由线粒体外膜上Tom受体识别与Hsp70或MSF(mitochodrial-import stimulating factor)等分子伴侣结合的过膜多肽，通过Tom-Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。 核定位蛋白的运转机制 1、核定位序列（nuclear location sequence, NLS): 定位在细胞核中蛋白所具有的信号肽，但蛋白质进入细胞核后NLS不被切除，且可能存在于蛋白质的任何部位。 2、核蛋白的运输需要 （1）核运转因子（importin, 、 ) ; （2）低分子量GTPase(Ran) 3、运转过程 （1）核运转因子的 亚基识别核蛋白的NLS，并与之结合

48、。 （2） NLS-核蛋白复合体与核运转因子的 亚基结合 （3）核运转因子-核蛋白复合体扩散到核孔附近与核孔复合物结合。 （4） GTPase水解GTP供能,将蛋白从细胞质转运到细胞核， 、 、核蛋白分开。 （5） 、进入细胞质运转下一个蛋白。三引物法实时定量PCR(Real-time quantative PCR)的技术原理 除了常规PCR的两个引物外，反应体系引入与模板DNA互补的第三个引物，该引物的5端带有短波长的荧光基团， 3端带有长波长的荧光基团，两者发出的荧光相互淬灭，检测不到荧光。当进行PCR时，Taq DNA 聚合酶可降解该引物，释放荧光基团，可检测到其发出荧光，荧光强度与合成

49、DNA的量成正相关。cDNA文库（cDNA library):将来源于某细胞或组织的全部mRNA反转录成cDNA，再与质粒DNA连接转化细菌，或噬菌体DNA连接再包装成噬菌体颗粒侵染细菌，得到一系列的克隆群体（菌落或噬菌斑），每一个克隆只含一种mRNA的信息，足够数目的克隆总和则包括了细胞或组织的全部mRNA信息，这样的克隆全体就是cDNA文库。cDNA文库构建方法（1）高质量mRNA的制备 提取组织总RNA(mRNA,tRNA, rRNA) mRNA与生物素标记的Oligo(dT)结合 加入亲和素标记的微磁球亲和素与生物素结合磁场分离微磁球（mRNA结合在微磁球上） 洗脱mRNA (2)反转

50、录成cDNA 三种方法： a: Oligo(dT)为引物合成cDNA b:由6个碱基组成的随机引物（R6)合成cDNA c: Oligo(dT)+R6合成cDNA 反应体系： mRNA, 引物，dNTP(dCTP为甲基化dCTP),反转录酶（3）与噬菌体DNA连接（4）噬菌体颗粒的包装与侵染完全基因敲除 置换型载体的正负双选择（positive-negative selection, PNS)正向选择：通过同源重组在靶基因内部插入抗生素抗性基因（如neor ）取代原基因，在抗生素培养基中筛选阳性克隆。负向选择：若负选择基因（如hsv-tk,单纯疱疹病毒-胸苷激酶，催化Gancidovir,即3

51、-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤磷酸化，细胞死亡）置于目的基因外侧，随机插入，靶基因未被敲除，带有负选择基因表达，正-负选择同时启用，确保抗生素基因插入基因内部。 5RACE的具体过程（1）提取总RNA(total RNA)（2）去磷酸化，有帽子结构的mRNA不受影响。（3）去掉mRNA的帽子结构，用RNA连接酶在mRNA5端连上人工接头。（4）以oligo(dT)为引物，反转录出cDNA的第一条链。（5）根据接头和cDNA的已知序列各设计一条引物，PCR扩增。（6）将PCR扩增产物克隆到载体，进行测序。 3RACE的具体过程（1）提取总RNA(total RNA)（2）以含有酶切位点的oligo(

52、dT)为引物合成cDNA的第一链。（3）根据酶切位点序列和cDNA的已知序列各设计一条引物，PCR扩增。（4）将PCR扩增产物克隆到载体，进行测序。酵母单杂交法 酵母单杂交体系（Yeast one-hybrid system): 用于研究真核生物DNA-蛋白质相互作用的一项技术，其基本原理是将特定的顺式作用元件插入到最基本启动子（minimal promoter, Pmin）的上游，把报告基因连在Pmin的下游。将编码转录因子的cDNA与酵母转录因子的激活结构域(AD)融合表达，构建在另一个质粒上，若融合蛋白能与顺式作用元件结合，就激活Pmin，引起报告基因的表达。酵母双杂交系统 酵母双杂交系

53、统（yeast two-hybrid system):研究蛋白质-蛋白质相互作用的一项技术。利用DNA重组技术将酵母转录因子（GAL1,GAL4)的AD基因与BD基因分别克隆到两个表达质粒上，在BD基因的插入目的基因，在AD上游插入cDNA，最后再构建一个插入顺式作用元件、Pmin和报告基因的第三个表达质粒。将上述三个质粒共同转化酵母细胞， BD基因与目的基因融合表达产生诱饵（Bait),AD基因与不同cDNA融合表达产生猎物（Prey），若诱饵上的目的蛋白与猎物上cDNA编码蛋白存在相互作用，诱饵-猎物结合，诱饵上BD与第三个质粒上的顺式作用元件结合，猎物上的AD激活报告基因表达，若报告基因

54、为LacZ，则在含X-gal的培养基上，相互作用菌落程蓝色。 基因图位克隆法 基因图位克隆法（map-based cloning）:根据基因连锁图，确定决定某种表现型基因的方法。 首先构建基因连锁图，将目的基因定位在染色体的特定位点，并在其两侧寻找紧密连锁的RFLP或RAPD分子。其次，构建大片段基因组文库,通过Southern blotting 找到含RFLP片段的克隆并测序。最后,通过染色体步移技术测定RFLP分子和目的基因之间 的序列，找到目的基因。RNAi机理： 双链干扰RNA（iRNA）在细胞内被Dicer(RNaseIII)降解成21-25bp片段，这些片段与RNA酶结合，形成RN

55、A诱导沉默复合体（RISC），其内RNA双链打开，识别目标mRNA，降解目标mRNA。 凝胶阻滞试验 凝胶阻滞试验（Electrophoretic mobility shift assay, EMSA;Gel retardation assay）： 体外研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其原理是：同位素标记的DNA与蛋白质结合后分子量变大，电泳时蛋白质-DNA复合物较游离DNA的泳动速度变慢，据此推断该蛋白质与DNA存在相互作用。 DNA印足技术 DNaseI足迹试验（DNase I foot-printing assay)：双链DNA的5端被同位素标记后，加入适量的DNaseI 切割，将DN

56、A切割成大小不等的若干片段，当DNA某个部位被蛋白质结合后，则限制了DNaseI的作用而不被切割，经过电泳、放射自显影后，则缺少了某些条带，形成空白足迹（foot print）,是研究蛋白质与DNA相互作用的技术。 原核基因转录水平上的调控（主要调控方式） 1、DNA结构对转录的影响 （1）启动子结构对转录的影响 （2）终止子结构对转录的影响 （3）增强子结构对转录的影响 （4）弱化子结构对转录的影响 2、RNA聚合酶的结构对转录水平的影响 原核生物的RNA聚合酶包括2, , 亚基。含不同 因子的RNA聚合酶识别不同基因启动子，从而调节不同基因的转录水平。 3、蛋白因子对转录水平的影响 一些调

57、节蛋白与启动子附近的DNA结合，引起相关基因转录水平的改变，或增加或降低。 4、小分子配基对转录水平的影响 一些小分子化合物与细胞膜上的受体结合，通过信号传导途径影响某些基因转录。分为：可诱导调节和可阻遏调节。 乳糖操纵子的结构模型操纵子包括：调节基因、启动子、操纵基因和结构基因等。 Lac乳糖操纵子结构：lac I: 调节基因；Plac: 启动子；lacO:操纵基因；lacZ: 半乳糖苷酶（分解乳糖成葡糖糖+半乳糖）lacY: 半乳糖苷透过酶；lacA： 半乳糖苷乙酰转移酶，催化乙酰半乳糖的形成。 1、E.coli培养基中含葡萄糖时，lacZ,lacY, lacA不表达 原因： （1）lac

58、I产生的阻遏蛋白结合在lacO上，RNA聚合酶无法与Plac结合， lacZ, lacY, lacA不转录。（2）葡萄糖 糖酵解产物抑制腺甘酸环化酶活性 cAMP浓度降低 cAMP-CRP浓度降低不能结合在Plac上 lacZ,lacY, lacA不转录。 CRP：代谢物激活蛋白，转录促进蛋白。 2、E.coli培养基中含乳糖时，lacZ, lacY, lacA表达原因：（1） lacI产生的阻遏蛋白与诱导物结合后变构，不能结合在lacO上，RNA聚合酶与Plac结合， lacZ, lacY, lacA转录。（2）葡萄糖酵解产物降低腺甘酸环化酶活性提高 cAMP浓度增大 cAMP-CRP浓度提

59、高结合在Plac上 lacZ, lacY, lacA转录。 NH3对固氮酶基因的调控作用 NH3除了直接抑制固氮酶的活性以外，还调控其它固氮基因的表达。高浓度NH3使胞内Gln: KG的比例提高，胞内GlnB蛋白与NtrB结合，该复合体使磷酸化的NtrC（活性）脱磷酸化，降低其它固氮基因的表达。低浓度NH3使胞内Gln: KG的比例下降，胞内GlnB蛋白在尿苷酸转移酶的作用下形成UMP-GlnB,而不与NtrB结合， UMP-GlnB 使NtrC（无活性）磷酸化变成活性形式，与NtrA, NifA共同促进其它固氮基因的表达。 真核细胞与原核细胞在DNA结构、转录和翻译方面存在的差异：（1）真核

60、细胞的DNA与组蛋白及非组蛋白结合，少量裸露；而原核细胞中的DNA大部分裸露，少部分结合与DNA复制、转录有关的酶类及调控蛋白。（2）真核细胞中有相当大的部分不转录，存在大量重复序列，基因内部还有不被翻译的内含子；原核细胞 DNA的重复序列少，基因内通常没有内含子。（3）真核生物在不同发育阶段会发生DNA的重排，原核生物该现象比较少见。（4）真核细胞中一条成熟mRNA通常只翻译出一条多肽链；而原核细胞中的mRNA很多都是多顺反子mRNA。（5）真核生物的转录产物（ hnRNA）需要经过复杂的剪接加工才能作为模板指导蛋白质的合成，而原核基因的转录产物通常不需要这些加工。（6）原核基因的转录调节区