第四组微生物大实验实验报告(共10页)

1、微生物大实验(shyn)土壤中芽孢杆菌的分离(fnl)及鉴定实验报告学 院：生命科学学院(xuyun) 专 业：生物技术班 级：组 数:学 号:姓 名:前言(qin yn)芽孢(y bo)杆菌是能形成(xngchng)芽孢 (内生孢子)的杆菌。芽孢是休眠体，不是繁殖体。绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与 DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。芽孢杆菌属是大的(410um), 革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。

2、芽孢杆菌属可分为以下亚群：多粘芽孢杆菌、枯草杆菌（包括蜡样杆菌和 HYPERLINK /view/1660828.htm t _blank 地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低PH值的有益微生物，本实验从土壤中分离出15株芽孢杆菌，从中挑选出一株芽孢杆菌进行生理生化鉴定，以及分子鉴定。通过进一步的实验，了解到其生理生化特点。一、实验(shyn)目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。将土壤(trng)样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。二、实验(shyn)原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。，

3、因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。三、实验仪器材料：1、仪器：显微镜、培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱、电泳仪、PCR仪、提取DNA试剂盒2、材料：培养基：LB培养基、淀粉培养基、孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇、硝酸盐、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖四、实验步骤：（一）、菌种的分离和纯化1、取样2、LB培养基的配制： 1L水、10g蛋白胨、5g牛肉膏、10g Nacl、15g琼脂、120灭菌30分钟待用3、平板及斜面的制备4、制备土壤菌悬液：称取土样约1g土壤放入盛有9ml无菌

4、水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上150r/min,振荡10min。使土样与水充分混合，使细胞分散。用一支1ml无菌吸光吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1 稀释液，以此类推制成10-2 ，10-3 .10-6等几种稀释度的土壤溶液。5、涂布：用无菌吸管分别(fnbi)吸取每个梯度0.2ml的土壤溶液，准确(zhnqu)放入PDA平板中，用无菌玻璃(b l)涂棒在培养及表面轻轻地涂布，使溶液分布均匀。室温下静置5-10min。6、培养：将平板置于28温箱培养1-2天。选择单个菌落挑取少量的菌苔，接种于斜面上。7、纯化： 挑取单菌落溶于无菌水中，充分震荡摇匀，

5、接种于已灭菌的LB培养基的平板上。8、初染：将纯化后得到的菌株进行革兰氏染色，并从中挑选出呈紫色的菌株，纯化保种并进行形态学、生理生化及分子鉴定（二）形态观察：1、个体形态特征观察2、群体形态特征观察（三）芽孢杆菌鉴定的生理生化试验1、好氧性试验细菌对氧气的需求是细菌鉴定的重要指标之一。若在培养基中加入还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠，可除去培养基中的氧气或氧化型的物质，使厌氧菌能在有氧条件下生长。 （1）培养基a、胰胨 20g K2HPO4 1.5g NaCl 2.5g 巯基醋酸钠 0.6g 美蓝 0.002g Na2SO3 0.2g L-胱氨酸 0.4g 蒸馏水 1000mL 琼脂 0.

6、5g pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa、121灭菌15min。b、酪素水解物 20g NaCl 5g 巯基醋酸钠 2g 甲醛次硫酸钠 1g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL pH7.2，分装试管（装量约1/2试管），0.1MPa、121灭菌20min，培养基不搁斜面。 （2）试验方法 取一环（接种环外径1.5mm）肉汤培养液，穿刺接种到上述培养基底部，30培养3d至7d观察结果。好氧菌在培养基上部生长，厌氧菌则在培养基底部生长。2、糖发酵(f jio)试验（木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇）糖类发酵产酸是细菌(xjn)分类鉴定的一项重要依据。（1）培养基 (NH4)2HP

7、O4 1g MgSO47H20 0.2g KCl 0.2g 酵母(jiom)膏 0.2g 糖或醇类 10g 水洗琼脂 56g 蒸馏水 1000mL 0.04%溴甲酚紫（或溴百里酚蓝）酒精液 20mL pH7.07.2，分装10100mm小试管，培养基高度34cm，0.05MPa，110灭菌20min。 （2）试验方法 取培养1824h的菌种，直针穿刺接种到培养基中，适温培养1、2、4、7、14d后观察结果。指示剂由紫色变黄（溴百里酚蓝由绿变黄），表示发酵糖类产酸，琼脂柱中出现气泡，则表示产气。3、M.R试验（甲基红试验）M.R试验和V.P试验分别测试细菌产酸和产生中性物质的能力。有的利用葡萄糖

8、产酸，使PH值低于4.2，并可维持4d以上。甲基红阴性的细菌可将产生的酸进一步代谢，在4d内生成中性化合物。因此，观察时间对于该项试验非常重要，一般细菌以4d观察为宜。如果细菌在4d期间M.R和V.P反应均为阳性，则应该培养较长的时间，以确定生成的酸是否已完全转变。（1）培养基 蛋白胨 5g 葡萄糖 5g NaCl 5g 蒸馏水 1000mL 调节pH至7.07.2,分装试管，每管45mL，0.05MPa，110灭菌20min。（2）试剂 甲基红 0.1g 95%酒精 300mL 蒸馏水 200mL（3）方法将菌种接种(jizhng)到上述培养基中，适温培养4、6d。在培养基中加入(jir)几

9、滴甲基红试剂，若培养基显红色，则为甲基红阳性，黄色，则为阴性。如为阴性，可适当延长培养时间。4、淀粉(dinfn)水解试验许多芽孢杆菌都能产生淀粉酶，可将培养基中的淀粉水解为糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。（1）培养基 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 淀粉 2g 琼脂 20g 水 1000mLpH7.27.4，分装三角瓶，0.1MPa，121灭菌20min。（2）方法将培养基熔化并冷却至50，倒平板，待冷却凝固后，取菌种点种于培养基上，每皿可点种35个菌株，适温培养24d，待长出菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以刚好铺满整个平板为宜。若菌落

10、周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。5、硝酸盐还原试验 有的细菌可将培养基中的NO3还原为NO2、NH3和N2等，硝酸盐还原作用的反应式如下： 2H 2H HNO3 HNO2 HNO H2NOH NH3H2O H2N2O2 H2ON2OH2O N2须注意反应(fnyng)过程中，NO3可能(knng)是最终产物，也可能是中间产物。如NO3被还原(hun yun)为NO2，加入格里斯试剂则培养基呈粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色。（1）培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基 1000mL KNO3 1g pH7.07.4，0.1MPa，121灭菌30min。（2）试剂a、格里斯试剂A液：对氨基苯磺酸 0.

11、5g 10%稀醋酸 150mLB液：萘胺 0.1g 蒸馏水 20mL 10%稀醋酸 150mLb、二苯胺试剂 称取0.5g二苯胺溶解于100mL浓H2SO4中，用20mL蒸馏水稀释。（3）方法 将试验菌种接种于培养基中（须做不接种的对照管），适温培养1、3、5d，取两支洁净的试管，倒如少许培养液，然后在其中分别各加一滴A液和B液，对照管加入同样的试剂。如培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色时，表示有NO2存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则进一步加入12滴二苯胺试剂，如培养液呈蓝色，则表示培养基中仍存在NO3，如培养液不显蓝色，则表示NO3和新形成的NO2均已还原成其他物质，仍按硝酸盐还原阳性记录。6、耐盐性试验（2、5、7%NaCl）该项试验可检测渗透压对细菌生长的影响。不同的细菌对盐的耐受性不同，可作为鉴别(jinbi)性特征之一。（1）培养基 在牛肉膏蛋白胨液体(yt)培养基中分别加入2、5、7、10%的NaCl。（2）方法(fngf) 将幼龄菌制成菌悬液，然后直针接种到培养基中，适温培养37d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。注意培养基要求必须十分澄清。（3）实验结果：形态观察：4、生理生化鉴定结果枯草芽孢杆