第18章生殖毒性研究

1、第18章生殖毒性研究第一节 致畸胎研究研究概况年份 事件作者19321935194819501956196319661971维生素A缺乏可使猴胚胎畸形X射线照射使大鼠胚胎发生各种畸形氮芥导致大鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形反应停（Thalidomide）事件美国药物安全委员会美国FDA 人用药生殖安全评价准则WHO规定新药应有生殖毒性研究HaleGobHarriuBaxter先天愚型海豹肢畸形 生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及上市的重要环节。

2、生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。生殖过程分期分期研究内容检测方法交配前到怀孕成年雄性/雌性动物的生殖功能；配子的发育和成熟；交配行为及生育力一般生殖毒性试验怀孕到着床成年雄性/雌性动物的生殖功能；着床前的发育和着床着床到硬腭闭合成年雄性/雌性动物的生殖功能；胚胎发和大部分器官形成致畸试验硬腭闭合到怀孕末期成年雌性动物的生殖功能；胚胎生长发育以及器官发育和生长出生到断奶成年雌性动物的生殖功能；婴儿在宫外生活的适应性；断奶前的发育和生长围产期试验断奶到性成熟断奶前的发育和生长；独立生活的能力；完全达到性成熟避孕药、性激素、性功

3、能障碍药、促精子生成药、致突变试验阳性或有毒作用的新药，必须进行生殖毒性试验。第二节 有关生殖毒性的基本概念 生殖是机体繁衍种族的生理过程，包括生殖细胞的发育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和发育、分娩和哺乳等过程。每一个环节均可能是化学物质毒性作用的靶部位，机体接触化学物质后干扰了其生理过程，使生殖过程的功能出现缺陷和损害，此即化学物质的生殖毒性。 生殖毒性有两个特点：（1）对化学物质的毒性作用敏感，一定剂量下，其他系统尚未出现损害之前，生殖过程中的某个环节或功能已经出现障碍；（2）化学物质毒性作用对其损害更为深远，不仅表现在接触化学物的机体本身，还可影响后代。第二节 有关生殖毒性的基本概念

4、 畸胎学：从胚胎学和病理学发展出来的一个分支学科，是研究胚胎发育时期，由各种内外因子引起结构和功能异常的先天性畸形的科学。 致畸性（teratogenicity）：药物接触胚胎发生期后引起永久性结构或功能异常的性质。 胚胎毒性（embryo toxicity）：某些药物在一定剂量仅对胚胎或胎儿有毒性作用而对母体没有毒性作用，此作用被称为胚胎毒性。胚胎毒性表现为胚胎死亡、胚胎生长迟缓、畸形和功能不全。 母体毒性（embryo toxicity ）：指药物引起怀孕动物的毒效应，如体重不增或减轻等，最严重的是死亡。第二节 有关生殖毒性的基本概念 畸形（malformations）：永久性结构异常或功

5、能异常的胎儿和新生儿。通常不包括显微镜下细微结构的异常, 生化代谢性缺陷。单纯功能异常(如精神缺陷、智力缺陷), 也不包括分娩过程中各种因素造成的缺陷。 致畸指数（teratogeny index）：为一种药物对母体的半数致死量与最小致畸量的比值，是表示一种化学物质的致畸强度指标。建议致畸指数在10以下定为不致畸，10 100为致畸，100以上为强致畸。 出生缺陷(birth defect)：指任何解剖学的和功能的异常。既包括形态结构的异常(大体的和细微的)，也包括功能、代谢、行为的异常。第三节 一般生殖毒性试验 目的 一般生殖毒性试验（reproductive toxicity test）是

6、研究药物对整个生殖过程的影响。包括生殖细胞（精子、卵细胞）的发生，卵细胞受精、着床胚胎形成，胚胎发育阶段的影响并作出评价。 动物及分组 至少一种动物，一般为大鼠或小鼠，每组雄性动物10只，雌性动物至少20只。第三节 一般生殖毒性试验 给药剂量及途径 给药组设高、中、低三个剂量；高剂量应能产生轻微毒性反应，如体重增长缓慢等，但不应出现严重中毒或死亡。 给药途径应尽量接近临床。 给药时间 雄性动物交配前给药60 80天，雌性动物交配连续给药14天。交配后继续给药至大多数器官发生期（大鼠/小鼠为孕后13天）。第三节 一般生殖毒性试验 检查雄性与雌性动物同笼交配后，每日检查小鼠阴道中有无阴栓，大鼠则检

7、查精子，以检查到阴栓或精子的当日作为妊娠第0天。雌鼠于妊娠第13天解剖观察，以确定妊娠、胎儿的吸收和死亡情况，并记录母鼠的一般状况、体重变化和胎盘重量，以确定子宫内的活胎数，对活胎进行性别鉴定、体重和身长的测量以及外表和内脏器官的形态学观察，对骨骼进行茜红素染色后进行检查，必要时进行组织学和组织化学的详细检查。第三节 一般生殖毒性试验 检查大鼠于孕期第20天处死（小鼠18天）。剖腹取出子宫及卵巢，辨认和记录活胎数，早死胎数、晚死胎数、吸收胎数和黄体数，对活胎仔应辨别性别、称重，测量身长及尾长，仔细检查活胎仔的外观有无畸形，将每只母鼠的2/3活胎仔剥去皮肤和内脏，经脱水透吸及茜红素染色后，检查骨

8、骼畸形，将1/3活胎仔浸入Bouin氏溶液中固定，供检查内脏畸形。第三节 一般生殖毒性试验 结果判定 100 %畸胎率% =畸胎总数活胎仔总数活胎仔平均畸形数 =畸形总数活胎仔总数100 %母体畸胎出现率% =出现畸胎母体数妊娠母体总数* 畸胎及畸形的计算方法第四节 繁殖试验 目的、原理 凡受试物能引起生殖机能障碍，干扰配子的形成或使生殖细胞受损，其结果除可影响受精卵或孕卵的着床而导致不孕外，尚可影响胚胎的发生及胎仔的发育，如胚胎死亡导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。如果对母体造成不良影响，出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常，亦可出现胎仔出生后发育异常。 本试验检测药物对整个生殖过程的毒性作

9、用，通过繁殖试验可以了解药物对试验动物的性腺功能、交配能力、受孕能力、妊娠过程、分娩、哺乳及对后代生长发育的影响。 一般倾向于二代繁殖试验。第四节 繁殖试验 动物及分组 大鼠，至少设三个剂量级和一个对照组。每组动物应至少能产仔20窝；F0代有生育能力的雄鼠至少10只，以后各代每组也应至少有10只雄鼠。 给药剂量 高、中、低三个剂量；高剂量应有毒性作用，但不能引起10%以上动物死亡，且超过人体预期接触水平。低剂量应不产生可观察到的有害作用。 方法 以人体可能接触的方式染毒。 仅对F0及F1代动物染毒。 F0代动物自离乳起（6 w之前）开始染毒，直到F1代离乳；F1代动物离乳（约30 d）后，部分

10、动物（用来继续繁殖的动物）每天染毒，直到F2代离乳后30天。 F0代给药至少100天后，开始交配，产生F1代。 F1代给药至少数120天后，开始交配，产生F2代。第四节 繁殖试验第四节 繁殖试验 观察指标 包括动物一般状态、体重、进食量及死亡情况；着重观察受孕率、妊娠率、出生存活率、产仔总数及平均仔重等与生殖机能有关指标。 计算下述生殖指数：100 %1. 生育力指数： 受孕率% =妊娠雌鼠数交配雌鼠数100 %2. 受孕指数： 正常妊娠率% =活产雌鼠数妊娠雌鼠数100 %3. 存活力指数：出生存活率% =生后4 d 存活仔数出生时活仔数100 %4. 哺育指数： 哺育存活率% =生后21

11、d 存活仔数出生后4 d 存活数第四节 繁殖试验第五节 致畸试验 原理 母体在孕期受到可通过胎盘屏障的药物作用,影响胚胎的器官发育,导致结构和机能的缺陷,出现胎仔畸形。因此在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时，可检出该物质对胎仔的致畸作用。 致畸试验（teratogenic test）为鉴定动物致畸物的标准方法。不仅能检测到药物的致畸性，也可得到有关药物致胚胎死亡及生长迟缓的资料。第五节 致畸试验 动物 要求选用对药物敏感性高而自发畸形率低的动物，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用2种动物，一种为啮齿类，另一种要求非啮齿类（狗和猴）。 动物受孕及检查方法 未交配过的雌鼠，鼠龄3

12、 m以下，体重200 - 250 g，做阴道分泌物涂片检查，若发现白色分泌物较多，镜下发现有核上皮细胞，则提示大鼠处于动情前期。此时，将其与雄鼠按21 或32同笼过夜，次日检查是否受孕。 检查是否受孕。（1）检查阴栓：阴栓是雄鼠精囊与凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒。大鼠阴栓易脱落，小鼠阴栓不易脱落。（2）阴道涂片检查精子。 阴栓或精子检出当日记为孕0天，次日为孕第1天。 第五节 致畸试验 剂量分组 分组 分高、中、低三个剂量组；阴性对照组；阳性对照组。 剂量确定 （1）高剂量应有母体毒性反应，或为最大给药量；低剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。 （2） 以 LD50 的

13、1/3 1/5 为高剂量组；以 LD50 的 1/30 1/100 为低剂量。 （3） 以人实际接触量做为低剂量组，并以其倍数（10倍）做为高剂量。 每组受孕动物数 大鼠、小鼠 15 20 只；兔 8 10 只；狗和猴 3 4 只。 第五节 致畸试验 给药方式及时间 给药途径根据药物的性质及人类可能的接触方式定，多为灌胃和腹腔注射。 给药时间选在胚胎对致畸物的易感期（器官形成期）。第五节 致畸试验 观察指标 1 每只实验动物在试验期间的受精日期、给药日期和剂量、体重等基本指标。 2 对母体的观察：每天检查有无中毒症状，对有流产或早产征兆者（阴道出血）及时处死检查。 3 对胎仔的观察A 活仔外形

14、的检查B 胎仔内脏检查C 对胎仔骨骼检查部位 畸 形头颅鼻眼耳腭颌和唇肢趾脊柱腹部尾肛门脑突出，露脑，颅脊柱裂，单纯性脑膜膨出单鼻孔，鼻孔扩张小眼，无眼，开眼，眼异位无耳，小耳，耳异位腭裂颌小，无颌，无口，唇裂短肢，畸形足多趾，少趾，缺趾，并趾脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱侧凸脐疝短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，无尾肛门闭锁常见畸形及部位（外观畸形）部位 畸 形颅顶骨枕骨颈椎骨胸骨肋骨腰椎四肢骨盘骨尾椎骨缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，错位，骨化迟缓多肋，少肋，短肋，分叉肋，波状肋，融合肋缺失，分裂，变形多骨，缺失缺失缺失，椎弓不连续，融合常见畸形及部位（骨骼畸形）部位 畸 形头腭口

15、腔眼心血管肺膈肠肝肾生殖器膀胱脑积水，脑室扩大腭裂短舌，分叉舌少眼，小眼，无眼右位心，室中隔缺损，单房室心，主动脉弓横位气管食管瘘，肺倒位，少叶横膈缺损，并引起腹内脏疝或内脏侧位肠疝肝异位，少叶马蹄肾，肾积水，肾积水，肾缺失，肾异位子宫缺失，睾丸缺失或隐睾，睾丸发育不全（单侧/双侧），两性畸形缺失常见畸形及部位（内脏畸形）第五节 致畸试验 结果评定 1 对母体动物评定： 100 %100 %母体畸胎出现率（%）=妊娠母体数交配率% =已交配动物数实验动物数死亡率% =死亡动物数实验动物数出现畸形胎的母体数100 %母体增重= 处死时母体体重 妊娠第6日体重 处死时子宫连胎重第五节 致畸试验 结

16、果评定 2 对胎仔评定： 100 吸收胎率（% ）=早期吸收数 + 中期吸收数 + 晚期吸收数实验动物数注意区分畸形数和畸胎数外观畸形率% =外观畸形数检查胎仔数100 %骨骼畸形率% =骨骼畸形数检查骨骼数100100 死胎率（%）=胎仔总数死胎数内脏畸形率% =内脏畸形数检查胎仔数100 %100活胎率（%）=胎仔总数活胎数第五节 致畸试验评定药物致畸作用应注意问题统计分析；剂量效应关系实验动物的自发畸形类型和频率变异种属差异、品系差异动物实验结果外推致人类时，须结合人群流行病学调查注意人类实际接触量及接触方式与途径第五节 致畸试验第六节 致畸作用机理 突变引起胚胎发育异常 细胞死亡和增殖速度减慢 细胞间通讯抑制 胚胎中间代谢障碍 胚胎组织发育过程不协调 渗透压不平衡