作物淀粉的三维荧光光谱指纹分析鉴定方法

1、作物淀粉的三维荧光光谱指纹分析鉴定方法淀粉是植物的主要能量储藏物质，由直链淀粉和支链淀粉组成。 直链淀粉是由葡萄糖残基以a-1，4糖昔键连接而成，基本上呈线型。 支链淀粉由许多小的直链分子组成，不同的小直链分子间以a-1，6 糖昔键连接，形成分支。直链淀粉和支链淀粉所占比例以及支链淀粉 的分支度决定淀粉的品质和用途。研究表明，淀粉是一种荧光物质， 不同来源作物的淀粉结构存在较大差异，构成不同作物特征性淀粉荧 光指纹图谱。三维荧光光谱（EEMs）技术作为一项有效的化学分析手段，具有 速度快、取样量少、信息量大、灵敏度高等特点，在水质分析、绿茶 成分鉴定、黄曲霉毒素等检测中发挥着重要的作用。平行因

2、子分析 （*）方法是一种针对三维复杂数据的分析方法，能够最大限度表 征样品中所有的荧光信息，将荧光信号分解成相对独立的荧光矩阵， 提高了分析的准确性。目前三维荧光光谱技术结合平行因子分析方法 已经成为研究水环境中有机物溶解动力学特征的重要工具。由于淀粉 不溶于水和有机溶液，文献采用淀粉悬液进行荧光光谱测定，但光谱 的均一性问题限制了淀粉荧光分析方法的普遍应用。本文采用淀粉固体粉末进行荧光光谱测定，对三维荧光光谱进行 平行因子分析，研究水稻、高粱、玉米等单子叶作物淀粉的荧光组分 特征，建立不同作物的荧光指纹图谱，并初步探讨了荧光组分特征、 表观直链淀粉含量（AAC）及水稻品种的相关性。1测量方法

3、1.1三维荧光光谱测量收集不同地区水稻品种53份、高粱品种14份、玉米品种18份。 将成熟水稻种子加工成精米后粉碎，再经37C。烘烤1周后过100目 筛子，备用。将高粱和玉米直接粉碎，37C烘烤一周后，过100目筛 子，备用。采用日立公司F-7000荧光光度计进行三维荧光光谱测定，配以 固体支架(零件号：650-0161)，扫描速度为2400mm/min，激发和 发射单色仪的狭缝设定为5mm，激发波长和发射波长的范围为200 900mm,步长为10mm。将采集到三种植物的三维荧光光谱数据存储 在Excel表中，并存储为fl.CSV形式。采用DOMFluor工具包在 MATLAB 2007a软件

4、上对待测样品三维荧光光谱数据进行平行因子分 析，分析中设置非负性限制，去除瑞利和拉曼散射，并去除离群样品， 对剩余样品的三维荧光光谱数据构建成相应作物的淀粉荧光组分数 据库。荧光组分的数目由折半分析法确定(split-half analysis)，每一 荧光组分的特征由组分EEMs表示，每个荧光组分在每个样品中的荧 光强度以Fmax (RU)表示。1.2水稻精米粉表观直链淀粉含量测定及统计分析准确称量10mg精米粉置于2mL离心管，加入100ul的无水乙 醇，震荡混匀，再加入900ul浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，震荡 混匀后放入30C。培养箱静置16 h使精米粉糊化。4份水稻不同表观

5、直链淀粉含量的标准样品(1.5%，10.2%，16.2%，26.4%)购于中国农 科院水稻研究所(杭州)，对这4份水稻按同样的方法同时进行糊化。经糊化后的檬品溶液与1 mL去离子水震荡混匀，取10ul稀释后 的糊化溶液与990ul碘/碘化钾溶液(20/0)混匀静置20 min;然后吸 取200ul反应液加入96孔透明细胞培养皿中，利用酶标仪(infinite M200 PRO)进行测定，测定波长为680 nm。采用SPSS软件进行相 关性分析，以及单因素方差分析。2结果与讨论2.1水稻精米淀粉的荧光组分根据*模型，识别出水稻精米淀粉中有4个荧光组分 (component，c)，其中c1和c2为

6、强荧光组分，如图1所示，图中 Ex为激发光谱，Em为发射光谱。组分c1和c2包括单一发射峰和2 个激发峰，组分 c1(200，280/310 nm)，组分 C2(250，360/440nm)。 组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰，组分C3 (290, 430/455, 570, 880nm),组分C4 (270, 410/480, 550, 820 nm)o2.2高梁淀粉的荧光组分根据*模型，识别出高粱淀粉中有4个荧光组分，其中cl和 c2为强荧光组分，如图2所示。组分cl和c2包括单一发射峰和2个 激发峰，组分 C1 (200, 270/290 nm),组分 C2 (25

7、0, 340/420 nm)。 组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰。组分 C3 (270, 400/430, 520, 800 nm),组分C4 (290, 430/430, 560, 860 nm)o2.3玉米淀粉的荧光组分根据*模型，识别出玉米淀粉中有4个荧光组分，其中cl和 c2为强荧光组分，如图3所示。组分cl和c2包括单一发射峰和2个 激发峰，组分 C1 (200, 270/310 nm),组分 C2 (240, 360/440nm)。 组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰，组分 C3 (270, 400/430, 530, 810nm),组分C

8、4 (290, 430/450, 570, 880 nm)。从3种作物的三维荧光光谱可以看出，不同来源淀粉的特征性荧 光组分存在偏移和重叠现象。相对于高梁和玉米，水稻淀粉组分c2 的荧光信号较弱。高粱淀粉组分c2的发射波长为420 nm,水稻和玉 米淀粉组分c2的发射波长为440 nm。水稻组分c3的激发和发射波 长发生红移等。因此，通过比较这些特征性荧光组分的波长和荧光强 弱可以区分不同来源的淀粉。2.4水稻荧光组分强度分布与亚种的相关性为了研究淀粉荧光组分与水稻亚种的相关性，我们分析了不同水 稻品种的荧光组分强度和粳籼稻亚种的相关性，不同水稻的荧光强度 测定结果如表1所示。研究表明，籼稻荧

9、光组分的荧光强度明显低于 粳稻的，经过单因素方差分析，确定籼稻和粳稻的淀粉荧光组分强度 具有显著差异，其中荧光组分2显著性p值小于0.01、荧光组分3显 著性p值小于0.01、荧光组分4显著性p值小于0.05，如表2所示。2.5水稻荧光组分强度分布与表观直链淀粉含量的相关性直链淀粉含量是水稻重要的品质性状之一，一般用表观直链淀粉 含量（AAC）来表征。为了确定荧光组分和直链淀粉的相关性，进一 步测定了这些品种的表观直链淀粉含量（AAC）如表3所示，分析了 水稻荧光组分强度与表观直链淀粉含量（AAC）的关系。经SPSS软 件统计分析，Pearson相关系数低于0.2,显著性p值双侧大于0.05， 说明两者之间没有相关性，如表4所示。3结论本文建立了固体样品淀粉荧光光谱测定方法，并通过指纹图谱区 分不同来源的淀粉。这种测定方法不但可以避免淀粉荧光测量时面临 的溶质不均性