Lipofectamine2000转染说明讲课稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Lipofectamine2000转染说明-LipofectamineTM2000CAT.NO.11668-027Size:0.75mlCAT.NO.11668-019Size:1.5ml4储存（不要冻存）说明：LipofectaminTM2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在HYPERLINK的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。在含有或是不含有血清的培养基中，DNA-LipofectaminTM2000复

2、合物能够直接加给细胞。在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。关于转染的一些重要建议：不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在HYPERLINK/rnai/rnai上有转染步骤，登陆后点击说明。对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(g)与LipofectamineTM2000(l)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEMI低血清培养基（Cat:NO.31985-062）（reducedserummedium）稀释LipofectamineTM2000和DNA.为了实现高的转染效率、高

3、的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。由于一些无血清复合物（如CD239、SFM=2*ROMANII、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和LipofectamineTM2000的相容性。转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。贴壁细胞：转染的前一天，在500l无抗生素培养基中接种0

4、.5-2105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500l无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8105。对于每个转染样品，按下面的方法准备：在50l无血清Opti-MEMI低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA，并轻轻混匀。使用前轻轻混匀LipofectamineTM2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。注意：要在30分钟内混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液。室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液（总体积为100l）。轻轻混匀并在室温下

5、静置20分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊）。注意：混合物在室温下的6个小时内不会失效。细胞板的每个孔中加混合液100l，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。检测目的基因的表达情况前，细胞于37CO2培养箱中培养18-48小时。此时不需要改变培养基，但4-6小时后也许需要更换.对于固定的细胞系：转染24小时后将细胞以1：10（或更高的稀释度）稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话，在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。对于悬浮的细胞系：转染4小时后，如果需要，加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。转染量度标准：在不同的组织培养板中转染细胞时，根据相

6、对的表面积，按比例加入LipofectamineTM2000、细胞、和培养基，具体情况剪下表。在自动、高产率体系中，建议96孔板的转染混合物的体积为50l。注意:操作时，可以直接将细胞混入转染混合物中进行快速的96孔板转染。在细胞板中准备好转染混合物，然后直接加入说明中正常100l体积时浓度的2倍浓度细胞培养液。在转染混合液存在情况下，细胞可以正常的贴壁。培养容器每个孔的表面积（cm2）相对于24孔板的表面积铺板培养基体积DNA(g)/培养基（l）LipofectamineTM2000（l）/培养基（l）96孔板0.30.2100l0.2g/25l0.5l/25l24孔板21500l0.8g/50l2.0l/50l12孔板421ml1.6g/100l1.0l/100l35mm板1052ml4.0g/250l10l/250l6孔板1052ml4.0g/250l10l/250l60mm板20105ml8.0g/0.5ml20l/0.5ml10cm板603015ml24g/1.5ml60l/1.5ml注意：表面积是根据培养容器的实际测量得到，但也会根据容器生产商的不同发生变化。优化转染：为了得到高的转染效率和低的无用副效应，通过改变细胞