8硝基白杨素对HL60细胞凋亡与PTENAkt途径的影响

1、8-硝基白杨素对HL-60细胞凋亡与PTEN-Akt途径的影响【摘要】目的不雅察8-硝基白杨素(NhR)按捺人急性髓性白血病细胞系HL-60细胞增殖和诱导凋亡作用，并探究其作用机制是否与PTEN-Akt信号传导途径相干。要领体外造就HL-60细胞。TT比色法检测增殖活性；流式细胞术F定量阐发细胞凋亡程度；esternBlt阐发HL-60细胞PTEN、P-Akt卵白表达的影响。效果NhR明显按捺HL-60细胞增殖，呈浓度依靠性，其I50值为1.34l/L；NhR具有诱导HL-60细胞凋亡作用，且呈浓度和时间依靠性。NhR以浓度和时间依靠方法上调HL-60细胞PTEN卵白表达和按捺P-Akt卵白表

2、达，其作用可被PPAR特异性阻断剂G9662(10l/L)预孵育拮抗。结论NhR诱导HL-60细胞凋亡作用与其活化PPAR，上调PTEN卵白表达，按捺按捺Akt磷酸化相干。【关键词】人急性髓性白血病白杨素凋亡白杨素(hR)是一种具有普及生物活性的黄酮类化合物，在蜂胶中含量较高，具有抗氧化、抗病毒、抗高血压并抗糖尿病等药理作用。以往的实行研究表白，hR按捺人甲状腺癌细胞生长；通过拮抗雌激素受体，按捺人乳腺癌细胞DNA合成；通过调控肿瘤坏死因子TNF-表达诱导人肝癌细胞凋亡。我们研究创造8硝基白杨素(NhR)按捺人胃癌(SG-7901)细胞、人结肠癌(HT-29)细胞作用较白杨素更强1。Sng等2

3、报道白杨素具有按捺卵白激酶K2,上调肿瘤按捺基因产物PTEN卵白表达，按捺Akt磷酸化作用。Kanari等3对子宫内膜癌的研究表现,PTEN卵白表达丧失构造中Akt磷酸化程度显着升高,两者呈明显负相干。本研究旨在不雅察NhR按捺HL-60细胞增殖和诱导凋亡作用及其与PTEN-Akt途径的相干性。1质料和要领1.1细胞与细胞造就HL-60细胞购于中国典范造就物收藏中央(中国武汉市)，用含体积分数为10%的胎牛血清(FS)的RPI-1640造就基在体积分数5%2，37，饱和湿度的细胞造就箱内造就，23d传代1次，取对数生恒久细胞用于实行。1.2药品与试剂NhR参照文献4要领合成，分子量299，黄色

4、晶体，纯度99.0。hR为美国Siga公司产物，全反式维甲酸、二甲基亚砜(DS)和G9662为美国Siga公司产物；鼠抗人PTEN单克隆抗体，鼠抗人P-Akt单克隆抗体及兔抗鼠IgG多克隆抗体由Santaruz生物公司消费，购于北京中杉金桥生物技能，小牛血清为杭州四序青生物产物；胎牛血清购于天津灏洋生物；PVDF膜购于Pall公司；胰酶、TT购于Aeres公司；1640造就基由GiB公司消费。1.4PI染色F阐发HL-60细胞经无血清造就基处置惩罚24h后，用含差异浓度药物的造就基别离处置惩罚48h后，网络细胞，用PBS吹打细胞成单细胞悬液，冷PBS洗2遍，用4的70%乙醇结实24h后，碘化丙

5、啶(PI)染色，上流式细胞仪(美国BD公司，FAS420)检测细胞凋亡环境。1.5esternblt阐发用1640造就基调解HL-60细胞浓度为2104/l接种于造就板中，每孔1l，参加10.0l/L的NhR孵育0，4，8，24h；网络细胞，于4裂解液中裂解，离心后举行卵白定量，用胎牛血清作为标化比拟组，加缓冲液(42Tris-l，10%glyerl，2.3%SDS，5%2-eraptethanl和0.02%brphenlblue)，煮沸5in后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，卵白被转移到PVDF膜上，别离用鼠抗人PTEN、p-Akt抗体孵育，参加过氧化物酶标识表记标帜二抗并使胶片感光。用PPAR

6、特异性阻断剂G9662实行检测NhR是否通过活化PPAR调控PTEN和p-Akt卵白表达。实行重复3次。1.6统计学处置惩罚各组实行数据均用s表现，接纳SPSSinds11.5软件neayANVA方法行方差阐发,两两比力接纳Studentst查验。2效果2.1NhR对HL-60细胞生长按捺作用差异浓度的NhR，ATRA，hR别离作用48h后，NhR能明显按捺HL-60细胞的增殖，呈剂量依靠性，其I50值为1.34l/L。NhR按捺HL-60细胞增殖作用的效价强度高于先导化合物hRP0.05，与阳性比拟物ATRA相称。见表1。表1NhR对HL-60细胞的生长按捺作用略与hR组比拟，*P0.01;

7、n=42.28硝基白杨素对HL-60细胞凋亡的影响NhR诱导HL-60细胞凋亡率达23.16%，而雷同浓度hR的凋亡率仅为5.8%，阳性比拟药物ATRA诱导的凋亡率是9.75%。见图1。图1PI染色F阐发8硝基白杨素诱导HL-60细胞凋亡略2.3NhR对HL-60细胞PTEN-Akt信号途径影响提示NhR以时间依靠方法上调HL-60细胞PTEN卵白表达，较0h别离上调80.212%,10924%和11927；以时间依靠方法下调HL-60细胞p-Akt卵白表达，较0h别离下调7.92%,65.56%和89.59(见图2)。PPAR特异性阻断剂G966210.0l/L预孵育30in后，NhR作用H

8、L-60细胞24h,创造G9662能有用拮抗NhR的上调HL-60细胞PTEN卵白表达作用见图3。图2esternblt阐发NhR1.0对HL-60细胞PTEN、p-Akt卵白表达的影响略图3PPAR特异性阻断剂G9662对NhR调控HL-60细胞PTEN卵白表达的影响略3讨论细胞凋亡Apptsis是指在特按时空产生的、受机体精细调控的细胞“自尽征象，与细胞恶性增殖和分化受阻一样，细胞凋亡非常在大多数恶性肿瘤的发病学上占据紧张的职位，而按捺增殖和诱导凋亡大概是差异作用机理的化疗药物发挥抗肿瘤作用的配合通路。本实行证明NhR以浓度依靠方法按捺HL-60细胞增殖，其作用效价强度是先导化合物hR的5

9、.3倍。PI染色流式细胞术F阐发创造，NhR1.0l/L作用48h的HL-60细胞凋亡率达23.16%，而雷同浓度hR的凋亡率仅为5.8%，阳性比拟药物ATRA诱导的凋亡率是9.75%。提示：NhR对HL-60细胞具有按捺增殖和诱导凋亡作用，且作用效价高于hR。PTEN是近期创造的一种新型肿瘤按捺基因，现已证明PTEN基因是第1个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，不但到场细胞周期的调控，并且调治细胞的正常生长和发育，终极促进细胞凋亡。PTEN可以特异性地按捺磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)依靠的卵白激酶B(PKB或Akt)的激活，而PI3K催化细胞膜上的(磷酸)肌醇磷酸化产生PIP2与PIP3，

10、PIP3激活卑劣的Akt。PTEN可以去磷酸化PIP3，拮抗PI3K的活性，低落细胞内PIP3的浓度，从而按捺Akt的激活。活化的Akt是促进细胞存活因子,能低落凋亡促进因子活性和增长抗凋亡卵白的活性5，Akt可以或许磷酸化Bad，后者开释被其按捺的抗凋亡卵白Bl-xL，磷酸化的Bad还通过阻断细胞色素的开释到场抗凋亡；Akt通过磷酸化按捺aspase-9的活性按捺凋亡。过氧化物酶体增殖体激活受体PPAR是一个核受体转录因子,可以或许上调PTEN的表达；而PPAR拮抗剂G9662可以或许按捺PPAR配体的这种作用6。多种恶性肿瘤存在PTEN基因的突变或缺失，导致PI3K/Akt信号通路活性增高

11、，Kandasay等7在肺癌细胞中转染PTEN可下调Akt程度，低落其对TRAIL凋亡途径的对抗性。因此，想法上调PIEN，按捺P-Akt表达，不失为抗肿瘤的一种途径。本实行用esternblt阐发创造，NhR以时间依靠方法上调HL-60细胞PTEN卵白表达和按捺P-Akt卵白表达。NhR的上调HL-60细胞PTEN卵白表达作用可被PPAR特异性阻断剂G9662(10l/L)预孵育拮抗。说明NhR大概通过活化PPAR，上调PTEN卵白表达，按捺Akt卵白磷酸化，诱导HL-60细胞凋亡。【参考文献】1ZhengX,engD,XuYY,etal.SynthesisandAntianereffetf

12、hrysinderivativesJ.BirgdeheLett,2022.ar10;13(5):881.2SngDH,DinguezI,izunJ,etal.K2phsphrylatinftheAradillRepeatreginf-ateninPtetiatesntsignalingJ.JBilhe.2022,278(26):24018.3KanariY,KigaaJ,ItahiH,etal.rrelatinbeteenlssfPTENexpressinandAktphsphrylatininendetrialarinaJ.linanerRes,2001,7(4):892.4ZhengX,engD,XuYY,etal.SynthesisandAntianereffetfhrysinderivativesJ.BirgdeheLett,2022.ar10;13(5):881.5ayLD,etal.ThePTEN,d2,p53tursuppressr-n-prtEinnetrkJ.TrendsBiheSi,2002,27(9):462.6FarrB,etal.AtivatinfPPARgaainreasesPTENexpressininpanreatianerellsJ.BiheBiphysResun