植物组织培养六ppt课件

1、 第七章 细胞培育 植物细胞培育plant cell culture是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进展培育使其增殖的技术根据培育规模:小规模培育和大批量培育；根据培育方式:悬浮培育、单细胞培育等；根据要求产物:用于诱变的细胞培育和消费次消费物的细胞培育。 1.单细胞分别由完好的植物器官分别单细胞由培育组织中分别单细胞1、由完好的植物器官分别单细胞叶片是分别单细胞的最好资料机械法酶解法撕去下表皮显露叶肉细胞用解剖刀刮下细胞1-1、 机械法第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心只需薄壁组织陈列松散，细胞间接触点很少时用机械法分别叶肉细胞才干获得胜

2、利。1-2、 酶解法Takebe等1968最早报道：用果胶酶处置可以分别大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心2、由培育组织分别单细胞 茎段步骤摇床用于振荡继代悬浮(3)Suspension culture)将愈伤组织在液体培育基中培育，建立悬浮培育物15ml medium/1g120rpm cultureTransfer1 time/3d 3 weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心 isolation留意： 选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常运用的外植体。 选择适宜的培育基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。 继代多次，以获得

3、均匀一致疏松的愈伤组织。 2.细胞悬浮培育(cell suspension culture) 一、细胞悬浮培育的概念和意义 悬浮培育是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培育基中进展培育增殖的技术。Bioreactor for continuous cell suspensions Shaker for suspension culture Culture wheel 1、细胞可以不断增殖，构成高密度 的细胞群体，适于大规模培育；2、可以提供大量较为均匀的细胞，为研讨细胞的生长、分化发明方法和条件。Cell suspensionPlantsArtificial seedsSecondary pr

4、oductsIsolation protoplastsMutation select细胞悬浮培育的运用 三.细胞悬浮培育的方法1、培育基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培育的培育基以原愈伤组织继代时的培育基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需求进展一些调理。 2、培育细胞的起始密度及细胞记数1最低有效密度的概念 在悬浮细胞培育中，使悬浮培育细胞可以增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培育资料、原种培育条件，原种保管时间长短、培育基的成分不同而有差别，普通为104105细胞/ml2细胞记数要保证细胞培育的最低有效密度，在细胞游离后要对

5、分别的单细胞进展记数，可用血球记数板。3活细胞测定除测定细胞密度外，尚需求测定活细胞率以作为测定起始密度的参考活细胞率%=5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数100% 活细胞测定的方法；A、醋酸酯荧光素FDA染色法 FDA本身无荧光，无极性，可自在经过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于遭到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自在出入原生质体膜，在荧光显微镜下察看到的荧光是有活力的，反之无活力。详细操作： 取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，参与FDA溶液，使最后浓度到达0.01%，混匀，室温下作用5min，荧光显微镜察看。B、酚藏红花染色法 先配制0.1%酚藏红花溶液，

6、溶剂为培育液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。3、悬浮培育细胞数目的增殖变化细胞生长各个时期的特点：滞后期延迟期:细胞很少分裂，其长短与接种量 大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期:细胞分裂活泼，细胞数目添加，增长速率坚持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培育液耗费将尽，有毒代谢 物质增多，氧气减少静止期:生长几乎处于停顿形状，细胞数目添加极少，甚至开场死亡。 讨论: A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培育细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。B、参与条件培育基可以缩短滞后期

7、。 条件培育基：曾培育过一段时间组织或细胞的培育基。C、缩短两次继代时间间隔，那么可使悬浮培育的细胞不断坚持对数生长期。D、假设使处在静止期的细胞悬浮液坚持时间太长，那么会引起细胞的大量死亡和解体。操作本卷须知：对悬浮培育细胞继代时，进液口的孔径要小，只能经过单细胞或小细胞团2- 4细胞，运用吸管或注射器。继代前，培育容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培育物。4、细胞生长的测定对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进展动态的测定，以掌握其生长的根本规律，为继代培育或其他研讨提供根据。A、细胞记数留意：由于悬浮培育的细胞并不会呈游离单细胞，因此 经过培育瓶

8、中直接取样很难进展可靠的细胞记数。可用5%8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进展处置生长速率pP=lnx-lnX0/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度B、细胞大小的测定技术用显微测微计C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培育液中细胞体积的毫升数来表示。D、细胞的干重和鲜重：将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重普通是将离心搜集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60烘12h，在枯燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重普通以每毫升悬浮培育物的分量表示

9、。E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进展的速度越快。 普通用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。5、一个胜利的悬浮细胞培育体系必需满足三个条件： 悬浮培育物分散性良好，细胞团较小，普通在3050个细胞以下，在实践培育中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞外形和细胞团大小大致一样。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培育基清澈透亮，细胞色泽呈艳丽的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量普通23天甚至更短时间便可添加一倍。 6、影响悬浮细胞生长的要素： 起

10、始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生才干强。其外观普通是色泽呈艳丽的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度普通在0.52.5105个细胞/毫升，低于这一密度那么会使细胞生长延迟。 培育条件：方式、温度、继代周期 四、悬浮细胞的同步化 细胞同步化是指同一悬浮培育体系的一切细胞都同时经过细胞周期的某一特定时期。 同一培育体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化形状等更趋复杂化，所以人们不断希望经过一定的技术途径，使同一培育体系中的细胞能坚持相对一致的细胞学和生理学形状，任务中常用的处置方法：1、物理方法1分

11、选法 经过细胞体积大小分级，直接将处于一样周期的细胞进展分选，然后将同一形状的细胞继代培育于同一培育体系中。悬浮液 47m膜过滤 滤液 31 m膜过滤 搜集参与到10%18%的Ficoll 参与等体积的培育基 网上细胞180g离心5min 搜集各细胞层的细胞 用培育基洗涤 分别接种2冷处置法：低温处置可以提高培育体系中细胞同步化的程度2、化学方法1饥饿法悬浮培育细胞中，假设断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培育基中重新参与这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2抑制剂法 经过一些DNA 合成抑制剂处置细胞，使细胞停留在DNA

12、合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3有丝分裂阻抑 用秋水仙素处置指数生长的悬浮培育物，浓度普通控制在0.2%，处置时间以4-6小时为宜无论何种细胞同步化处置，对细胞本身或多或少都有一定的损伤。假设处置的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还能够呵斥细胞的大量死亡，因此在进展同步化处置之前，细胞必需进展充分的活化培育。用于处置的细胞系最益处于对数生长期。 3.单细胞培育技术一、植物单细胞培育的意义1、建立单细胞无性系 悬浮培育细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差别，这些差别反映在它们的产量、质量、抗

13、病虫性和抗逆性等方面。假设能将高抗、高产、高质量的细胞株挑选出来，无疑会带来宏大的经济效益。2、排除体细胞的干扰3、利于对细胞活动跟踪察看二、单细胞培育的方法1、细胞平板培育 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培育基上进展培育，称之为平板培育主要技术要点： 单细胞的分别：普通采用酶分别法，小细胞团不能超越6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择适宜。单细胞悬浮液的制备：分别的单细胞经培育基洗涤2次以后，调整密度为5105/ml植板： 将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培育基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培育皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的

14、培育基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培育皿封严以防污染在25黑暗条件下培育3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。植板率评价：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率()(构成的细胞团数/接种的细胞数)100计算式中每个平板新构成的细胞团数的计数方法有两种：一是直接计数法，留意计量时要掌握适宜的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一同的时候。二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培育皿下，其上放一光源使培育皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。2、看护培育概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培育方法。3、微室培育概念：人

15、工制造一个小室，将单细胞培育在小室中的少量培育基上，使其分裂增殖构成细胞团的方法，称微室培育。特点：1能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖构成细胞团的全过程2培育基少，营养和水分难以坚持，pH值变动幅度大，培育细胞仅能短期分裂。4、其它单细胞培育技术A豢养层培育基技术 将豢养细胞先用射线辐射处置，然后将豢养细胞和培育细胞混合植板，经过照射的细胞对于培育细胞起到一个豢养作用。B双层滤纸植板培育方法培育基豢养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培育细胞4.植物细胞大规模培育与次生代谢 产物消费一. 概述 二. 培育系统 三. 植物细胞规模培育技术要点四. 提高细胞次生代谢产物的途径 五. 细胞规模化培育中的有关技

16、术问题 一、概述植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次消费物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。所以把这一技术以为是植物细胞的“发酵工程。A、有特殊的类似发酵工业反响器的消费系统和回收工艺。B、与植物的栽培不同，而与发酵工业类似，是独立众多的外界环境要素包括天气、地理、季节、寄生物等的消费过程。C、有较稳定的产品的质量和数量，可节省耕地，也可看作是一个“农作物的储存库。1. 植物产生代谢产物的类型植物次消费物种类繁多据保守估计已超越2万种，根据分子构造不同大致分为：酚类化合物黄酮类单酚类醌 类苯醌、萘

17、醌、蒽醌萜类化合物三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物碱真生物碱、伪生物碱、原生物碱胺类伯、仲、叔、季胺非蛋白质氨基酸多炔类、有机酸等2植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍1593在中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次消费物。 产品成分 用途 年销售额（亿美元）长春花碱（长春花）治疗白血病 1820（美国）阿吗灵 循环系统障碍药 525（全世界）奎宁（金鸡纳树） 治疗疟疾 510（美国）致热素 杀虫剂20（全世界）毛地黄 心脏病药 2055（美国） 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和

18、名贵化装品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：从胡萝卜、万寿菊提取色素从黄菊提取芳香油栀子提取果酸：果酸含有大量的维生素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化装行业用于制造护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液。 3规模化细胞培育是消费植物次消费物的理想途径 维护生态环境 提高消费效率 开展新型生物技术产业生产方式 生产周期 紫草宁含量（干重） 完整植株 23年 12 植物细胞培养3周14 来自于植物体和细胞培育的紫草宁含量比较 4、植物细胞培育的特性1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2

19、培育过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为直径达350mm一400mm的团块，悬浮培育较难；4)培育时需供氧，培育液粘度大：5)具有群体效应；6)由于有细胞壁, 培育细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7)细胞培育过程具有构造与功能全能性,因此易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8)悬浮培育中要求有一定的细胞浓度，否那么不生长2500050000个/ml。 5、植物细胞培育需求处理的问题1氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；2营养物的供应；3细胞密度过高引起细胞聚会甚至分化4培育过程中细胞分化的防止，5细胞培育中微生物的去除；6细胞壁脆性

20、的存在要求培育体系剪切力要小；二.培育系统 1.悬浮培育系统 机械搅拌式培育系统 机械搅拌式生物反响器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的根底上作如下改良： 搅拌安装要减少剪切，普通改叶轮式为螺旋式。 由于植物细胞生长周期长，需求随时补充水分和营养，因此必需设计加液安装； 由于植物细胞的生理活动需求新颖空气，且细胞代谢也能够产生有害气体，所以必需设计通气安装；为便于取样察看，普通还设计有取样口。机械搅拌式培育系统气压搅拌式培育系统 思索到机械搅拌式反响器的剪切作用难以防止，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培育物污染的部位，因此，开展出空气提升式生物反响器，但其缺陷是搅拌不均匀。 旋转式培育

21、系统普通用于产品中试或某些必需裂解细胞才干获得目的产物的培育，其优点是控制准确，处置灵敏，缺陷是培育体积较小。 2、固定化培育系统细胞固定化培育技术按照其支持物不同可以分为两大类： 包埋式固定化培育系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培育系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等资料。平床培育系统。本系统由培育、液罐和动泵等构成。新颖的细胞被固定在床底部由聚屏烯等资料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培育床的上方，经过管道向下滴注培育液。培育床上的营养液再经过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培育体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次

22、生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。2立柱培育系统本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1-2 cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即滴液区比例大大提高，次生物质的合成大为加强，同时占地面积大为减小。 这一技术的优点在于： 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的形状，相互间接触亲密，可以构成一定的理化梯度，有利于次消费物的合成； 由于细胞固定在支持物上，培育基可以不断改换，可以从培育基中提取产物，免除了培育基中因含有过多的初消费物对细胞代谢的反响抑制，

23、也由于细胞留在反响器中，新的培育基可以再次利用这些细胞消费初消费物，从而节省了消费细胞所付出的时间和费用； 正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培育基中不断提取产物，因此，它可以进展延续消费。可以较容易地控制培育系统的理化环境，从而可以研讨特定的代谢途径，并便于调理；植物细胞固定化培育时必需思索以下几个问题： 所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量能否很高，细胞生长速度能否较慢并能维持较长时间的生活才干； 所选用的固定支持物对细胞的存活能否有影响，对产物的合成能否有妨碍； 终产物能否能释放到培育基中，假设产物不释放到培育基中，能否能采用物理(电击)或化学(离子浸透法)方法使其释放而又不影响细

24、胞生活力。三.植物细胞规模培育技术要点1.细胞系的建立和选择 悬浮细胞系 单细胞养与挑选 种细胞增殖有效成分分析2.优良细胞系的增殖培育 所选择的优良细胞系，进展大规模繁衍，得到足够的细胞是建立细胞规模化培育体系的中间环节。 3.大规模培育体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，普通采用此方法建立大规模培育系统。 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进展，细胞生长和产物合成需求不同的培育基的类型。先在细胞生长培育基中培育大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培育基中培育。 假设采用固相培育方式消费次消费物，普通均需采用两步法建立体系

25、。 四.提高细胞次生代谢产物的途径1明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停顿生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停顿以后。如紫草宁的合成。 2、选择适宜的起始资料首先必需选择可以高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培育资料还应思索器官和组织特异性，通常选取自然形状下可以积累次消费物的部位，这样的细胞经过培育后常具有合成目的产物

26、的才干，或比较容易诱导合成目的产物。同时要挑选高产、稳产的细胞株系。3、选择适宜的培育基成分普通来说，添加培育基的N，P、K的浓度能促进细胞生长，而适当添加糖浓度有利于次消费物的合成。培育基的成分包括培育条件要经过一定的实验才干选择出既有利于细胞大量生长繁衍又有利于次生代谢产物大量产生的培育基。4、前体 植物培育细胞具有能将有机化合物进展化学转化的宏大潜力，这些化学反响包括皂化、酯化、醛基化、羧基化、异构化、甲基化及双键复原等。因此可在培育基中参与适当的进展上述化学反响的前体，便有能够为我们得到需求的化学转达化目的产物。5、激发子的运用植物细胞次生代谢除了本身的遗传或发育根底外，通常还与诱导因

27、子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著加强。因此，人为合理的运用这些诱导因子，就有能够提高目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指可以诱导植物细胞中一个反响，并构成细胞特征性本身防御反响的分子。A、非生物激发子，如辐射、金属离子等B、生物激发子，外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。6、培育技术的选择 包括对反响器的选择和对培育方式的选择，就目前的技术根底来讲，固定化培育是植物细胞规模化消费较为理想的系统为了同时满足细胞生长和产物合成的需求，通常需求在不同阶段运用不同的培育基，即两阶段培育 为理处理产物对

28、合成的反响抑制可以采用两相培育技术，液-液系统：分别相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。 普通来说，提取相的选择目的是具有较大的分别才干，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。五植物细胞规模化培育中的有关工程技术问题 1悬浮培育系统必需顺应植物细胞特性 2植物细胞培育液的流变特性 植物细胞培育液的流变特性常用粘度来描画 培育过程中培育液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌物以及细胞形状引起。 如烟草培育液的表观粘度培育过程中主要是由培育细胞密度的添加引起的，当细胞密度低于7gL-1时，培育液的粘度根本坚持不变，而当细胞密度高于此

29、值时，培育液的粘度即添加。 长春花细胞培育，当细胞密度在10 gL-1时，培育液属于假塑性流体，此时，培育液的粘度依赖于细胞年龄、形状和细胞团的大小。 在一样物质浓度下，大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培育液的表观粘度。 3植物细胞培育过程中的气体调理 O2： KLa体积氧传送系数，单位时间、单位体积氧量：如在4L的气升式反响器中进展长春花细胞培育时，KLa在20h-1左右时，细胞生长与次消费物合成均维持在良好形状；又如在15L的通风式反响器中培育的烟草细胞，当 KLa值在510h-1的范围内，随着 KLa的添加，生物量和代谢产物也呈线性添加。 溶氧浓度：曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培育进展培育，结果显示，当培育基氧浓度从10%饱和度上升至30%时，细胞的生长速率从0.15d-1上升至0.20-1，假设溶氧浓度继续上升至40%饱和度时，细胞生长速率反而下降至0.17d-1。 CO2： 植物细胞能非光合地