基因工程复习重点(共25页)

1、安徽师范大学生命科学学院2011级生物技术专业（仅供参考） 基因工程(jyn gngchng)复习重点第一章 绪论(xln)1.克隆(k ln)：当它作为名词使用时，是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体；当它作为动词使用时，是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。因此，基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。 2.基因工程诞生于1973年。3.在现代分子生物学研究领域中，理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用。1）理论上的三大发现（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA而不是

2、蛋白质。 （2）50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式，即中心法则的建立和遗传密码子的破译。2）技术上的三大发明（1）利用限制酶和连接酶体外切割和连接DNA片段。（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条通路。4.基因工程：对不同生物的遗传物质-基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。五个方面的工程技术系统（基因、细胞、酶、微生物发酵

3、、生化工程）是相互依赖、相辅相成的，但系统中基因工程占主导地位。5.基因工程研究内容包括以下几个主要步骤：（1）从现有的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等方法，获得带有目的基因的DNA片段。（2）在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有选择标记的载体分子上，形成能够自主复制的重组DNA分子。（3）将重组DNA分子转移到适宜的受体细胞，并使其一起增殖。（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。（6）将分离到的目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使之在新的遗传背

4、景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。6.基因工程的四大要素：目的基因、工具酶、载体、受体。7.1976年6月23日，美国国立卫生研究院（NIH）正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。 8.我国的基因工程相关法规：1990年制定基因工程产品质量控制标准；1993年发布基因工程安全管理办法；1996年发布农业生物基因工程安全管理实施办法；2001年发布农业转基因生物安全管理条例 第二章 基因工程的理论基础与基本技术1.操纵子：由几个功能(gngnng)相关的结构基因成簇排列而组成的一个基因表达的协同单位，称为操纵子。如：调节(tioji)基因、启动子、操纵基因、结构(jigu)基因共同组成

5、一个操作子。 2.内含子：是一个基因中非编码DNA片段，它分开相邻的外显子。 3.外显子：是一个基因中编码蛋白序列。严格地说，外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域，包括5非翻译区(5UTR)、编码序列和3非翻译区(3 UTR)。 4.GT-AG法则：序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT，3端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守 性和存在的广泛性，有人把它称为GT-AG法则，即5 GT AG 3。 5.卫星DNA：真核生物基因组中高度重复的DNA，有一些2030bp的极短序列，且以数千个拷贝的串连方式排列，这种序列称为卫星DNA。（在染色体DNA片段的氯化铯

6、密度梯度离心中，由于浮力密度的不同，这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带，因此称之为卫星DNA。）6. Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用： A、用Poly（T）作为合成cDNA第一链的引物； B、用Poly（T）纯化柱从总RNA中分离mRNA。7.可诱导调节是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 可阻遏调节是指基因平时都是开启的，处在产生蛋白质和酶的工作过程中，但由于一些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。8.基因工程操作中应注意的真核生物与原核生物的差异基因结构的差异启动子和

7、RNA聚合酶的差异蛋白质的翻译后修饰加工（前体切割、二硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、软脂化）基因表达的调节（表达量）载体的差异蛋白质的纯化方便结构基因是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者转录 成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋白质和酶。 从广义上讲，任何一种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因，一般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先转录成mRNA，然后由mRNA翻译成阻遏蛋白质或激活蛋白质，通常也称为转录因子或反式作用因子。它们通常结合到

8、结构基因的非编码区的顺式元件上起调控作用。 10.具有相同遗传信息的个体细胞间其所利用的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的，而有的基因则在一些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。前者称为管家基因，如编码核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被称为奢侈基因。11.假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。12.基因组是指一个生物体、细胞器或病毒的全部(qunb)基因。原核(yun h)生物基因组仅由一条环状的双链DNA分子组成，含有一个复制起点，它的基因组就是(jish)它的整个染色体。但对于二倍体的高等

9、生物，能维持配子体正常功能的最低数目的一套染色体构成的一个基因组。对于植物细胞而言，则有3个基因组，即染色体基因组(核基因组)、线粒体基因组和叶绿体基因组。13.碱抽提法提取质粒DNA（1）原理DNA双链在强碱条件下变性为DNA单链，而单链在中性条件下又可复性为双链。闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和（或）有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2）所用试剂溶菌酶【在碱性条件（pH8）下有活性。】：能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中 的-1，4糖苷键。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗

10、透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTA ：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA 酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液（冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8）：用来中和NaOH变性液，使 DNA复性。【高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。】乙醇：用于沉淀DNA。（DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环 境。）RNase A ：降解R

11、NA，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE缓冲液 ：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。【Tris-HCl不含金属离子（不同于 磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。】酚-氯仿: 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留 在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。14.计算DNA浓度：ssDNA：ssDNA=33（OD260OD310）稀释倍数dsDNA：dsDNA=50（OD260OD310）稀释倍数ssRNA：ssRNA=40（OD260OD310）稀释倍数15.衡量提取DNA

12、的纯度OD260/OD280 1.8 可能有RNA污染OD260/OD280 1.8 可能有蛋白质污染16.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。17.琼脂糖凝胶电泳的原理(yunl)：溴化乙锭（EB）是扁平分子(fnz)，能插入DNA碱基之间， 300nm紫外光照射(zhosh)下能发红色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。18.相同分子量的DNA： 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。19.琼脂糖凝胶的分辨力：空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过

13、； 空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。20.影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些？（1）DNA分子的大小。（2）DNA的构象。（3）琼脂糖浓度。（4）溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。（5）电压。（6）电泳缓冲液的成分及浓度。21.聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。（琼脂糖凝胶电泳：分离30050000bp；聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离11000bp）22.核酸的分子杂交：Southern blot-用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。Northern blot-用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。原位杂交-对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性

14、菌落。23.聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA片段。 1986年 H.A. Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段（37)，PCR技术才进入实用阶段。1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中，使PCR自动循环仪成为可能。PCR技术的原理：模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸引物：人工合

15、成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。引物为什么优先与模板互补配对？（浓度高，配对序列短）PCR的特点：（1）特异性强 （2）敏感性高 （3）快速(kui s) （4）简便(jinbin) （5）可以(ky)扩增mRNA Taq DNA聚合酶的特点：（1）热稳定性，最适温度高（为75-80）；（2）具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性；（因此不能修复错误的碱基配对！）（3）Taq的PCR产物3端往往带有一个A；（4）Taq DNA聚合酶的激活剂，金属离子敏感（尤其是Mg2+）。 Pfu DNA Polymerase：有3 5的外切酶活性，5

16、 3外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端！ 影响 PCR的因素：（1）DNA聚合酶活性 （2）引物（3）模板（纯度、模板的量）（4）dNTPs（5）Mg 2+ 的浓度引物设计应注意的问题有：1）引物的位置：与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）；2）引物的长度：一般引物设计为长1530bp；3）尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右；4）避免形成引物二聚体；5）避免连续相同碱基排列或内部回文序列；6）3端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸；7）3端必须与模板正确配

17、对，5端可以不配对，5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便于以后操作。注引物的Tm值手工计算：Tm=（G+C)4 + (A+T)2标准的PCR反应体系 100ul 25ul1. 引物 各0.1umol2. 4种dNTP 各200umol/L3. 10 buffer 10ul 2.5ul4. 模板DNA 0.12ug 0.0250.5ug5. Taq酶 2.5u 0.625u6. Mg2+ 1.5mmol/L7. ddH2O 加至100ul 加至25ul如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多

18、种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物：设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。PCR技术的延伸技术：荧光实时定量PCR 【Realtime PCR（或TaqMan PCR）】 借助于荧光(ynggung)信号来检测(jin c)PCR产物(chnw)。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 Ct值：样品到达阈值水平所经历的循环数。 （2）反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列。技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。（3

19、）不对称PCR 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。（4）反转录PCR（RT-PCR) 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（5）巢式PCR（Nest-PCR）（6）原位PCR(in-situ PCR)（7）锚定PCR（anchored PCR）定义：扩增已知序列侧翼未知序列的一种PCR方法，未知的3端添加一同聚物尾（polyG），以互补的同聚物引物（polyC）和按已知序列设计的引物一起作PCR扩增。关键：利用末端转移酶在未知一端创造引物结合位点。（8）长片段

20、PCR（ Long PCR）（9）多重PCR（ multiplex PCR）定义：又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。 （10）RAPD【随机扩增多态性DNA (Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记)】定义：用一个（有时用两个）随机引物（一般6-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。AFLP【扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP 标记）】（12）RFLP【限制

21、性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP 标记）】（13） SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（15个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。 （14）ISSRISSR（inter-simple sequence repeat）重复序列的间隔序列的扩增（15） SSCP分析单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism)PCR技术的应用：（1）扩

22、增某一段DNA （2）基因(jyn)的体外诱变（3）基因组的比较(bjio)研究 24.双脱氧(tu yng)链终止法原理：（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二酯键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。 （5）各碱基随机终止产生所有不同长度的产物。（6）根据电泳条带的先后次序，读出合成链碱基序列，互补配对推出模板链碱基序列。技术要点：（1）制备单链DNA模板（2）特殊的DNA多聚酶不能有53和35的外切酶活性；与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（3）制备2和3双脱氧的ddNTP（dNTP

23、/ ddNTP = 100 / 1）（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）注化学裂解法读出的序列就是要测的序列。Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。第三章 基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶1.定义：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。2.限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物

24、质和外来遗传物质的作用机制。3.类型：I 型、II型、III型4. II型限制性内切酶（分离的第一个酶是Hind ）（1）识别位点序列: 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。与 DNA的来源无关。（2）切割位点: 识别位点处。（3）同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。（4）同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。注：同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。（5）如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。EcoR I和BamH I等都

25、有*活性。（6）s型限制性内切酶移动切割：s型限制与修饰系统，与型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的(不是从识别位点序列中间断裂），长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。应用(yngyng)：基因表达系列分析(fnx)技术(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达(biod)模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频

26、率。5.命名：（1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。（2）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoR I）。（3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。（4）限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。6.识别序列的长短与切割频率：识别序列越长，切割频率越小（越短，越大）7.相邻序列效应：大多数限制性核酸内切酶对只含识别序列的寡核苷酸是不具催化活性。 位点偏爱：不仅侧翼序列长短与限制性核

27、酸内切酶的切割效率有关，而且发现侧翼序列的核苷酸组成与切割效率也有关系。8.影响限制性内切酶活性的因素1）DNA的纯度 2）DNA的甲基化程度 3）温度（大多数是37 ，少数要求40-65 ）4）缓冲液 9.完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。（通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）10. 几种常用限制酶识别位点：二、DNA连接酶1.两种DNA连接酶：（1）大肠杆菌连接酶（只能连接粘性末端）（2）T4噬菌体的连接酶（不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端）2.连接条件：（1）必须是两条双链DNA；（2）DNA 3

28、端有游离(yul)的-OH，5端有一个磷酸(ln sun)基团（P）；（3）需要(xyo)能量：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：NAD+3.影响连接反应的因素：1）插入片段与载体的浓度比例 插入片段浓度高，至少21。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。2）反应温度（一般1416）三、DNA聚合酶1.常用的DNA聚合酶的共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3OH端。A、都以dNTP为底物。B、都需要Mg2+激活。C、聚合时必须有模板链和具有3-OH末端的引物链。D、链的延伸方向都为53。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。2.用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I

29、 可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成为Klenow fragment。3.切口平移法：DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。4.放射性标记的优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。 缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害、要求在专门 实验室操作。5.地高辛的识别抗地高辛抗体，生物素的识别亲和素6.常用的两种偶联酶：辣根过氧化物酶（HRPO）、碱性磷酸酶（AP）作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发

30、出荧光（或生成有色的产物）。7.用非放射性标记的探针检测原理：探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。四、DNA修饰酶（一）末端(m dun)脱氧核苷酸转移酶的特性： 需要(xyo)3OH、二甲(r ji)胂酸缓冲液； 不需要模板； 底物可以是单链DNA、3OH突出的双链DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以； 随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。T4多核苷酸激酶的功能：催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH 端。不论5-OH端突出与否。（三）碱性磷酸酶1.种类

31、：细菌性碱性磷酸酶（BAP）：从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）：从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68可完全失活。2.特性：催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3.功能：防止线性化的载体份子自我连接（四）S1核酸酶1.特性：（1）高度单链特异性（2）反应条件： 低水平Zn2+ pH4.04.32.功能：（1）催化单链RNA或DNA降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。（3）降解限制酶切形成的单链突出端。（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链。基因工程载体质粒载体的容量相对较小，受转化率、拷贝数的影响。M13噬菌体包装DNA分子的能力可达其DNA长度的6倍。

32、6407bp*6噬菌粒能插入10kb的外源DNA。载体的最大克隆容量是23kb。（实际上为15kb）柯斯质粒45kb。（最少不能低于30kb）细菌人工染色体克隆容量可达300kb。载体的定义 广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。基因工程对载体的要求（1）具有对受体细胞的可转移性，可提高载体导入受体细胞的效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的复制原点或整合位点，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。（3）具有多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点)，可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）

33、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害。载体的种类1）按来源基因工程中常用的载体有5类：质粒、单链DNA噬菌体M13、噬菌体的衍生物、柯斯质粒、动物病毒 2）按功能分：克隆载体-克隆一个基因或DNA片段 表达载体-用于一个基因(jyn)的蛋白表达 整合(zhn h)载体-把一个基因插入到染色体组中一、质粒载体(zit)1.质粒：是独立于染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子。2.氯化铯密度梯度离心结果自上而下依次为：蛋白质、ocDNA/L-DNA、cccDNA、RNAs3.质粒的类型：1）依据质粒自身传递

34、的性质分类在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒-能自我转移 非接合型质粒-不能自我转移2）依据可否引起宿主细胞出现新性状分类显性质粒：宿主细胞由于含有质粒而获得新性状隐蔽质粒：宿主细胞含有此类质粒而无异样性状3）依据质粒的复制特性分类A. 严紧型质粒（拷贝数少，接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。B. 松弛型质粒（拷贝数多，非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。4.质粒的不亲和性：能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒。 5.第一个用于基

35、因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1 kb。6.人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体（2）低拷贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体（4）插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体（6）表达型质粒载体7.利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件?1）普通载体元件：复制起始点ORI、选择标记、 多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件：阻遏基因I、操纵基因O、启动基因P、核糖体结合位点序列（SD）、 转录终止信号区8. pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。9.蓝白斑选择原理：1） Xgal2） -半乳糖苷酶Xg

36、al显色反应：-半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。3） lacZ的肽互补 -肽（ lacZ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。 lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 受体菌lacZ突变 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基(nj)端有缺失（缺失肽）， 不能形成(xngchng)4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。 载体(zit)lacZ与互补pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。 互补的插入失活pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆

37、位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。4） IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑；MCS有插入时，不互补，白菌斑。穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。TA克隆载体：研制出的一种线形质粒，其3端各带一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方

38、式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为TA克隆载体。（原理：Taq酶特点）质粒载体增加寄主新陈代谢负荷：复制负荷转录和翻译负荷 （使寄主细胞生长减缓；丢失质粒的细胞反而会成为优势群体。）原噬菌体：整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细 菌的染色体复制而复制。M13噬菌体没有包装限制：M13噬菌体包装DNA分子的能力可达M13DNA长度的6倍。6407bp*6噬菌粒载体：由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。16.噬菌体展示：将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。17.cos位点：DN

39、A两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。18.pBluescript SK/KS（+/-）区分：SK：表示lacZ的转录方向是沿MCS上的 SacI KpnI KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）+（f1+）：单链复制起始方向背离lacZ，能回收lacZ的编码链（+）-（f1-）：能回收lacZ的非编码链（-）19.噬菌粒载体的包装：辅助噬菌体：自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。噬菌体包装：外壳蛋白和复制蛋白辅助噬菌体ssDNA噬菌粒载体载体(zit)的体外包装（1）定义(dngy)：在试

40、管中与噬菌体的头部和尾部(wi b)蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。（2）噬菌体外壳蛋白的合成E 基因：的E基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。D基因：的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。注噬菌体体外包装的容量限制：必须在正常野生型容量的75%-105%（3651kb）之间。21.cosmid载体（粘粒）1）组成： DNA：cos序列和控制包装的序列。pBR322：质粒的复制子；抗药性基因；几个限制性酶的单一位点。2）特点：具有噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体

41、颗粒而溶菌）。克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。3）应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。理论依据：cos位点：包装识别。“多联体”复制：噬菌体的生命周期中，会产生数百个DNA通过cos位点连接的“多联体”分子。Ter体系：在包装的时候，噬菌体具有位点特异的末端酶体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个DNA长度。包装限制

42、：两个cos位点之间，必须保持3845kb的DNA，Ter体系才能识别。野生型 噬菌体DNA的75105。22.酵母人工染色体（YAC）的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。YAC的组成结构：（1）着丝粒区（CEN）（2）端粒（TEL）（3）复制起点（ORI）（4）克隆位点（5）在酵母中的标记基因（6）在细菌中操作的复制起点ori和抗生素标记Ampr 23.染色体复制和遗传的三个基本(jbn)组件：DNA复制(fzh)起始点（ori）、着丝粒（cen）、两个(lin )端粒（tel）24.F质粒的特点：（1）单拷贝复

43、制。（2）克隆容量可达300kb。（3）比较稳定。 （4）便于提纯。目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因1.关于亚磷酸三酯法：化学合成的方向：35；核苷酸单体的磷酸基团在3端；亚磷酸三酯法的磷为3价磷，需要氧化。2.寡聚核苷酸化学合成的优点：1）直接合成基因：mRNA的含量很低，很难作cDNA 有些基因比较短，化学合成费用较低2）合成引物（20mer左右）3）合成探针序列4）定点突变合成5）合成人工接头或衔接物6）合成DNA芯片3.衔接物：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。人工接头：用化学合成法合成的一段不等长双链DNA序列，一

44、头平末端、另一头粘性末端（为某种酶切所产生的粘性末端）。4.基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。5.基因组文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f )P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）F：插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）文库的查询：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。6.cDNA：

45、以mRNA为模板逆转录出的DNA。cDNA library：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。7.cDNA文库的特点：（1）不含内含子序列。 （2）可以(ky)在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码(bin m)蛋白质的基因。 （4）比DNA文库(wnk)小的多，容易构建。cDNA文库的大小：一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-1/n)P：文库包含了完整mRNA的概率（99%）1/n：某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载

46、体数（克隆数）8.cDNA的合成： cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 cDNA第二链合成 剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 去掉发卡结构 用核酸酶S1可切掉发卡结构（会导致cDNA中有用的序列被切掉）。9.妙用RNaseH 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片段。小片段正好成为DNA

47、聚合酶的引物，用来合成冈崎片段。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。10. mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。 从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟基磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。11. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）（1）3端的锚定引物 Oligo(dT)引物

48、的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。（2）12种锚定引物（3）5端的随机引物（4）随机引物与锚定引物成对扩增（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较 不同(b tn)组织的240组引物组合(zh)PCR产物在测序胶中电泳。选择(xunz)有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。12.cDNA差示分析法：1）cDNA模板制备；2）用DpnSau 3A分别消化两组cDNA，再接上接头R，经补平末端后作为下一步PCR扩增的模板；3）加入根据R设计的一对引物，利用PCR技术使两组的cDNA片段得以富集后，再用DpnSau 3A去除cDNA两端的R；4）消减杂交。将上一步

49、获得的tester的cDNA接上新的接头J，按tester:driver为1：100的 比例混合两组cDNA，在一定的反应体系中解链并进行充分的杂交反应，这样便有3种 形式的杂交体形成，即A driver：driverB driver：testerC tester：tester；5）利用PCR反应使tester的特异基因得以富集。A不能扩增、B线性扩增、C 指数扩增。13.盒式PCR（Cassette PCR）是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。 14.RACE技术 R

50、ACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA 第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5之间的未知序列的方法,分别称为3-RACE或 5-RACE。锚定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。15.转座子标签法 转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。 图位克隆法：根据目的基因在基因组上的位置特性而不是其编码产物来进行基因克隆。1

51、7.染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。18.染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。如能找到与目的基因的物理距离小于基因组文库的平均插入片段的长度的紧密连锁的分子标记，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移，这种方法称为染色体登陆。 19.酵母双杂交系统1）作用：有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质2）原理：结构域（Doma

52、in）合作： 许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4；实验发现-只要DNA binding domain（DNA-BD）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。拆开(chi ki) Domain：用重组(zhn z)DNA技术(jsh)把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。重组Domain： 用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。观察报告基因表达：通过效应基因是否被激活来检查：在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。.如果蛋白A与蛋白

53、B不能相互结合 GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。.如果蛋白A与蛋白B能相互结合GAL4的DB domain与AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。基因的重组与转移外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞一、齐平末端的连接1. 直接连接 5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接；T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的10%。2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾法 原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端

54、加上脱氧核苷酸。加尾碱基互补：分别给载体和插入片段加上互补的核苷酸。（2）衔接物(linker)连接 linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（3）DNA接头 (adapter)连接法 adapter：一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 adapter的作用：用T4DNA连接酶连到平端DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。二、PCR产物(chnw)的连接1. 在引物的5端设计(shj)酶切位点（1）设计原则：符合载体的多克隆位点；避

55、免(bmin)与所扩增的DNA片段内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物的结构：3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。（5端多余的35bp起保护碱基作用）2. 与T载体直接连接（1）PCR产物两个3端一般都有一个A（2）平末端载体两个3端各加一个T三、DNA体外连接应注意的事项1.插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接；尽量避免平端连接；决不能进行非粘性末端连接。2. DNA插入的方向正确用双酶切：由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码：尤其当载体上有ATG起始密码

56、的时候，更要注意。4. 防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量 （2）用碱性磷酸酶处理载体四、感受态大肠杆菌的制备1.目的：增加受体菌细胞膜的通透性。2.菌种：使用丧失了限制体系的大肠杆菌。3.制备原理：用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。4.制备过程（了解）五、重组DNA导入大肠杆菌1.外源DNA导入细菌的几种方法：（1）转化（transformation）：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection）：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。（3）转导（transduction）：借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。2.转化率：每gDNA转化成功的细菌克隆数

57、。 3.转化方法：（1）热休克法：简单，但转化效率不高（2）电转化法：转化效率高六、感受态细胞 （1）生长状态：制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。（2）必须在冰冷的条件下制备。（3）CaCl2处理：要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。（4）储存感受态菌要在-70以下。（5）使用感受态菌时必须梯度融化。（融化后一般不能再次冻存使用）七、cI857基因突变的噬菌体 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。 但由于(yuy)该噬菌体的S基因上有一

58、个(y )突变，所以细菌还不裂解。 S和R是控制寄主细菌发生(fshng)溶菌作用的两个基因，故称溶菌基因。 八、互补型噬菌体 在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。 噬菌体1：外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。 噬菌体2：外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。九、导入植物细胞1.叶盘法 2.电击法 3.基因枪法十、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法 2.脂质体载体法 3.显微注射法4. DEAE葡萄糖转染法 5.病毒介导重组体克隆的筛选和鉴定一、pBR32

59、2抗菌素标记选择1.四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。2.氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（蓝灰色）褪色。3.环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 注：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸 平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。二、-半乳糖苷酶显色反应选择法 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖

60、苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。三、根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷 2.增加新性状四、DNA电泳检测法 1.直接电泳检测法 2.酶切电泳筛选法五、PCR扩增检测法1.原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。2.过程：（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否(sh fu)与外源基因一致。六、核酸(h sun)杂交检测法 1. Southern blotting 2. Northern blottin