DB35_T 1995-2021禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术

1、ICS11.220CCSB 4135 福建省地方标准DB35/T 19952021禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome2021 - 08 - 17 发布2021 - 11 - 17 实施福建省市场监督管理局发 布 DB35/T 19952021目次 HYPERLINK l _bookmark0 前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 疫病概述15 设备、材料和试剂26 样品的采集、保存和处理27 样品中

2、病毒 DNA 提取38 荧光定量 PCR 操作步骤39 结果判定310 测序4附录 A（规范性） 试剂的配制及引物序列5附录 B（资料性） 扩增产物参考基因序列和荧光定量 PCR 扩增曲线图6I 前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。 本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、万春

3、和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。 II 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR 诊断技术范围本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处理和保存，样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。 本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽心包积液-肝炎综合征 fowl hydropercardium-hepatitis syndrome；HHS由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。 3.2禽腺

4、病毒 4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4引起禽心包积液-肝炎综合征的病原。 3.3循环阈值 cycle threshold；Ct 值荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 疫病概述禽心包积液-肝炎综合征（HHS），最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前，该病呈现世界范围分布，多个国家、地区相继报道该病的发生，各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈

5、现不同程度肿胀，质地较脆、易碎，有出血斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆，有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于35周龄肉鸡，1020周龄蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4 d后开始死亡，死亡期可持续7 d 10 d，发病率和病死率分别为10%30%和20%75%。该病一年四季均可发生，以水平传播为主，也可垂直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。 1 DB35/T 19952021设备、材料和试剂设备台式冷冻高速离心机（转速应12 000 r/min）。 水浴锅或金属浴。 5.1.3 微量可调移液器（量程分别为 100 L1 000 L、20 L200 L

6、、2 L20 L、0.5 L 10 L）。 荧光定量 PCR 仪。 旋涡混合仪 材料和试剂棉拭子稀释液：配比按照附录 A 的 A.1。 组织稀释液：配比按照附录 A 的 A.2。 10% SDS 溶液：配比按照附录 A 的 A.3。 3 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH5.2）：配比按照附录 A 的 A.4。 75%乙醇：配比按照附录 A 的 A.5。 荧光定量 PCR 检测用引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录 A 的 A.6。 蛋白酶 K、Tris 饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇：直接购买成品使用。 Probe qPCR 试剂盒：应与荧光定量 PCR 仪相配套的探

7、针 qPCR 试剂盒。 PCR 反应管：与荧光定量 PCR 仪相配套的 PCR 反应管。 阳性对照：含 FAdV-4 目的基因片段的质粒 DNA（拷贝数2.13104/L）。 阴性对照：Nuclease-free Water。 样品的采集、保存和处理样品的采集棉拭子样品的采样将棉拭子插入咽喉或泄殖腔旋转35次，取出放入盛有1.0 mL棉拭子稀释液的1.5 mL无菌离心管中。 组织样品的采集无菌采集病禽有明显病变的肝脏、脾脏等组织。 样品保存样品采集后应保存在2 8 条件下，24 h内送达实验室。超过24 h的应保存在-20 条件下， 且时间不应超过7 d。如需长期保存，须保存在-70 -80

8、条件下。 样品的处理棉拭子样品的处理取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15 s，4 、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 2 DB35/T 19952021组织样品的处理取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆，转入1.5 mL无菌离心管中，反复冻融23次后，4 、5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 样品中病毒 DNA 提取常规方法提取 DNA取 540 L 上清液，先加 60 L 10% SDS 溶液后，再加蛋白酶 K 至终浓度 50 g/mL，于旋涡混合仪上混匀 15 s，置 56 孵育 2 h。 加入等体积 Tris 饱和苯酚，于旋

9、涡混合仪上混匀 15 s 后，置 4 、12 000 r/min 离心 15 min。 离心后吸取上清液转移至 1.5 mL 无菌离心管（注意不要吸出中间层），加入等体积酚:氯仿: 异戊醇（25:24:1），颠倒混匀 15 s，静置 5 min 后，置 4 、12 000 r/min 离心 15 min，吸取上清液转至其他无菌离心管中。 7.1.4 重复 7.1.3 步骤 1 次。 加入相当于上清液 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH5.2）、2 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀 15 s，-20 沉淀 2 h。 于 4 下 12 000 r/min 离心 15 min 后倾去上

10、清液，加入 800 L 75%乙醇溶解沉淀物，置 4 下 12 000 r/min 离心 5 min 后吸尽残余液体；再以 75%乙醇溶解沉淀物 1 次，置 4 下 12 000 r/min 离心 5 min，吸尽残余液体；置 4 下 12 000 r/min 离心 5 s 后吸尽残余液体，室温静置 5 min。 加入 50 L 灭菌双蒸水溶解沉淀物，冰浴备用。提取的 DNA 应于 2 h 内进行荧光定量 PCR 或保存于-20 条件下。 商品化试剂盒提取 DNA病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取试剂盒提取。 荧光定量 PCR 操作步骤在PCR反应管中分别加入以下试剂：Probe qP

11、CR mix 10 L，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4 L， 探针引物FAdV-4-P 0.8 L，模板DNA 2.0 L，加Nuclease-free Water至总体积20 L，混匀，离心5 s。将PCR反应管放入定量PCR仪，扩增反应条件：95 预变性2 min；95 变性10 s，60 退火30 s，共40个循环；最后保存于4 。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一个。 结果判定阳性对照有典型的扩增曲线，且Ct值27；阴性对照无扩增曲线，且无Ct值；两者均符合，方可判定检测结果有效，见附录B的B.1。 待检样品Ct值32时，且出现典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测

12、阳性，见附录B的B.1。待检样品Ct值35时，或无典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阴性，见附录B的B.1。 待检样品32Ct值35时判为可疑，应重做；重做时待检样品Ct值32判为FAdV-4核酸检测阳性， 待检样品Ct值32判为FAdV-4核酸检测阴性。 3 DB35/T 19952021测序必要时可对定量PCR产物进行测序，参考序列参见附录B的B.2。 4 DB35/T 19952021附 录 A（规范性）试剂的配制及引物序列棉拭子稀释液0.01 mol/L PBS缓冲液中添加青霉素（10 000 IU/mL）、链霉素（10 mg/mL）、庆大霉素（250 pg/mL） 和制霉菌素（

13、5 000 IU/mL），调节pH至7.27.4。 组织稀释液0.01 mol/L PBS缓冲液中添加青霉素（2 000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 pg/mL） 和制霉菌素（1 000 IU/mL），调节pH至7.27.4。 10% SDS 溶液称量10 g十二烷基硫酸钠，加入90 mL灭菌双蒸水，小心搅拌，缓慢加热至水温在25 以上使之完全溶解。 3 mol/L 的醋酸钠缓冲溶液取800 mL水加入408 g三水醋酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1 000 mL。 75%乙醇量取750 mL的无水乙醇加入250 mL的灭菌双蒸水。 荧光定量 P

14、CR 检测用引物序列荧光定量PCR检测用引物序列为： 正向引物 FAdV-4-F：5-CCCGATCTCAGTCAAATT-3； 反向引物 FAdV-4-R：5-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3； 探针引物 FAdV-4-P：5-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3。 荧光定量PCR扩增片段为196 bp，引物和探针用双蒸水溶解至10 mol/L，保存于-20 备用。 5 DB35/T 19952021附 录 B（资料性）荧光定量 PCR 扩增曲线图和扩增产物参考基因序列荧光定量 PCR 扩增曲线图以建立的荧光定量PCR诊断技术对2份阳性样品和2份阴性样品进行检测，同时设阳性对照和阴性对照，结果见图B.1。 标引序号说明： I-阳性对照； N-阴性对照； 2-阳性样品； 3-阳性样品； 4-阴性样品； 5-阴性样品。 图B.1 荧光定量 PCR 扩增曲线图扩增产物参考基因序列选择FAdV-4 GDMZ 株（ GenBank 的登录号： MG8