生物仪器分析期末重点

1、名词解释精密度（precision）：是指用同样的方法所测得的数据相互一致性的程度，是表征数据随机误差大小的一个量，一般用标准偏差来度量，标准偏差越大，仪器精密度越低。检出限（detection limit）：指在适当的置信水平上被检出的组分的最小量。灵敏度（sensitivity）：物质单位浓度或单位质量的变化所引起的响应信号值变化的程度，也就是校正曲线的斜率，斜率越大，则灵敏度越大。沉降系数：指单位离心力作用下颗粒的沉降速度。沉降速度：在离心作用下颗粒在单位时间内运动的距离。生色团：指分子中能吸收紫外或可见光的基团，其含有非键轨道和分子轨道的电子体系。主要包括乙烯基、羧基、亚硝基、偶氮基、

2、乙炔基、氰基。助色团：指能使生色团吸收峰向长波方向移动并增强其强度的基团。溶剂效应：指由溶剂极性不同造成的化合物吸收光谱的红移或蓝移现象。蓝移：溶液极性增强，导致激发态能量下降，并且导致跃迁所需能量下降，最大吸收波长max发生红移。红移：溶剂极性增强，导致跃迁所需能量增大，最大吸收波长max发生蓝移。增色效应：由于助色团或生色团的引入，以及溶剂的影响，吸收强度增大。减色效应：由于基团取代或溶剂的影响，吸收强度减小。溶剂效应：指由溶剂极性不同造成的化合物吸收光谱的红移或蓝移现象。朗伯比尔定律：当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程成正比关系。AlgT= kbc A

3、: 吸光度，T : 透射比， K :比例常数，b : 光程(溶液厚度)，c :溶液浓度半峰宽：一半荧光强度时，所对应的发射波长范围，被称为荧光半峰宽。荧光寿命()：当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经历的时间，它表示荧光分子S1激发态的平均寿命。 在没有非辐射跃迁发生的情况下， = 1/kfkf : 荧光发射的速率常数，即单位时间内发射的光子数K：各种分子内的非辐射跃迁过程的速率常数之和荧光量子产率：荧光物质吸收后，所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数的比值。荧光量子产率越大，单位浓度的荧光物质的荧光强度越大，荧光性能更加优越荧光淬灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作

4、用而引起的荧光量子产率降低的作用。19、荧光阈值：在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。20、CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。21、死时间(t M )：不被固定相吸附或溶解的物质经过色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间。22、分配系数 (K )：它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度比。23、分配比 (kappa) ：分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的质量比，即 ：24、分离因子：也称为选

5、择因子，是样品中两个最难分离组分(A和B)的相对保留值之比。25、亲和色谱：是利用生物分子和固定相表面存在的某种特异性的靶向性和亲和力，进行选择性分离的一种方法。26、固定相：通常是在担体表面键合具有生物识别能力的生物分子(配体)，担体如果是凝胶，还可以实现“亲和尺寸排阻”双重作用。27、显微镜分辨率(resolution)：指显微镜将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离(即最小分辨距离)来表示。28、焦点深度：简称焦深，指在使用显微镜时，当焦点对准标本某一点时，不仅看清这一点，而且它的上下两侧也能同时看清楚，看到的物体不仅仅是一个平面，而且还能看到一

6、定的厚度，这个清晰的厚度就是焦深。29、镜像亮度(image brightness)：指显微镜中观察到的图像的明暗程度，在一定放大倍数下，与数值孔径的平方成正比。30、视场亮度(field brightness)：指显微镜中观察到的整个视场的明暗程度。31、分离度：又叫分辨率，是相邻两组分(A和B)色谱峰保留值之差的两倍与两组分色谱峰底宽之和的比值。填空、选择、判断知识点1：1）玻璃匀浆器 原理：筒状套管和槌管之间的挤压作用 应用：动物细胞和组织 优点：温和、便捷 缺点：效率较低、不适合于植物组织和微生物细胞的破碎2）超声波细胞破碎仪原理：超声波在液体中的空化效应，压迫、挤碎细胞 应用：细菌细

7、胞、动物细胞、以及组织破碎 优点：快速、高效缺点：作用剧烈，容易破坏蛋白质相互作用，厚壁细胞（如酵母和植物细胞）的破碎效率较低3）玻璃珠细胞破碎仪原理：在剧烈震荡中，通过玻璃珠的球磨作用破碎细胞应用：微生物细胞、动植物细胞、组织、尤其是某些厚壁细胞的破碎（如酵母细胞和植物细胞）优点：快速、高效缺点：样品处理量低，仪器噪音大，容易发热，对样品产生影响4）高压细胞破碎仪原理：高压产生的挤压作用破碎细胞或组织应用：几乎所有微生物细胞、动植物细胞优点：快速、高效、处理量大、可低温控制缺点：价格相对昂贵5）高速组织捣碎机原理：通过叶片刀高速搅拌应用：较为坚硬的组织或样品，如骨骼、植物果实，一般用于细胞破

8、碎前的组织样本预处理优点：处理质地坚硬的样品缺点：容易过热影响样品，并且不适合处理细胞样品6）高温消解仪原理：通过高温、强酸（硝酸）、强氧化剂（高锰酸钾）彻底破坏细胞或组织的结构应用：针对所有样本，为元素分析制备样品，如重金属含量的检测1、为了研究植物细胞内蛋白质相互作用，破碎较为坚硬的植物叶片，应该首选（B）制备得到细胞浆液后，再用（E）破碎细胞A 玻璃匀浆器； B 高速组织捣碎机；C 超声波细胞破碎仪； D 高温消解仪；E 高压细胞破碎仪2、为了测定大米中重金属镉含量是否超标，应选用（D）制备样品A 玻璃匀浆器； B 高速组织捣碎机；C 超声波细胞破碎仪； D 高温消解仪；E 高压细胞破碎

9、仪知识点2：颗粒最大、最沉的下沉的快，质量相同形状不同的，球形颗粒比不规则形状的颗粒要快，密度大的比密度小的快，水中的颗粒沉降比油中的颗粒沉降快。知识点3：知识点4：溶剂效应：指由溶剂极性不同造成的化合物吸收光谱的红移或蓝移现象，例如：*跃迁：溶液极性增强，导致激发态能量下降，激发态极性大于基态极性，下降更多，并且导致跃迁所需能量下降，最大吸收波长max发生红移。n*跃迁：溶剂极性增强，基态n电子容易与极性溶剂形成氢键，从而降低基态能量，导致跃迁所需能量增大，最大吸收波长max发生蓝移。知识点5：代表性生物分子的紫外-可见吸收光谱大多数氨基酸在可见光区(380-750 nm)和近紫外区(200

10、-380 nm)范围内没有吸收，只有芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)具有近紫外区（280nm）的吸收，因为它们的R基带有苯环共轭 键系统。1、苯丙氨酸(Phe)max : 257 nm max : 200 Lmol-1 cm-1 2、酪氨酸(Tyr)max : 275 nm max : 1400 Lmol-1 cm-1 3、色氨酸(Trp)max : 280 nm max : 5600 Lmol-1 cm-1 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使得碱基、核苷、核苷酸和核酸分子在240-290 nm处具有强烈吸收，最大吸收值在260 nm附近。核酸分子的紫外吸收与其碱基的相互作用具有很大关系，其

11、中变性(单链)核酸分子的max 相对于双链核酸分子的max大，这是由于双链的形成导致碱基对的电子云发生重叠，产生减色效应，减少了对紫外光的吸收。DNA变性(增色效应)；DNA复性(减色效应最有用的吸收光谱往往是基于n*跃迁和*跃迁而产生的。5、核酸的定量和纯度检测纯DNA： OD260 / OD280 = 1.8；OD260 / OD230 = 2.5 纯RNA： OD260 / OD280 = 2.0 ；OD260 / OD230 = 2.5 OD260 / OD280 1.8 或 2.0，则样品污染了蛋白质或苯酚类物质OD260 / OD230 2.5，则样品污染了糖类、无机盐和有机溶剂知

12、识点6：荧光与磷光的比较：产生过程：荧光是从S1 S0的辐射跃迁，磷光是从T1 S0的辐射跃迁2）寿命：荧光寿命较短10-710-9s，磷光寿命较长10-410s 知识点7：生物样本自荧光的主要来源 苯丙氨酸Phe 酪氨酸Tyr 色氨酸Trp来源：蛋白质(由芳香族氨基酸引起)和一些小分子代谢物特点：荧光强度较弱，最大发射波长一般小于500 nm还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)最大激发波长：340 nm；最大发射波长：450 nm知识点8：设计qPCR 实验的关键一步是选择监测目标序列扩增的化学方法，可用的荧光化学方法多种多样，被分为2 大类：1）DNA 结合染料（SYBR Gree

13、n I），2）荧光探针（分子信标和TaqMan）这一类方法利用荧光共振能量传递（FRET），或一些其它荧光淬灭形式来保证仅在扩增产物出现时特异的荧光知识点9：优化的qPCR实验应该满足以下几方面的要求：标准品、待检测的未知样品和阴性对照样品，在相同条件下和同一次qPCR实验环境中进行扩增；每个样品至少具有3个平行重复，且检测到的 CT 值波动范围在 0.1-0.2之内，表明各重复样品的数据具有良好的一致性；标准曲线的相关系数(R2)大于0.98，表明各标准品具有一致的扩增效率；标准曲线的斜率应在 -3 到 -3.5 之间，能够反映出标准品的10倍梯度稀释关系；扩增效率应在 90-105%之间，

14、表明反应体系具有良好的扩增性能；如果是SYBR Green I 法，熔链曲线分析中，只出现单一峰，表明扩增过程具有良好的特异性，扩增产物仅为单一的目的片段，结果可靠；7. 通过熔链曲线分析，阴性对照中无扩增发生，既不会产生特异性产物，也不会产生非特异性产物，表明整个扩增体系和过程中，没有污染外源DNA片段，并且不会产生非特异性优化方法：1、无扩增产物：降低退火温度， 增加模板用量， 增加镁离子浓度，减少dNTP用量，增加酶用量，重新设计引物2、非特异性：提高退火温度， 减少模板用量， 减少镁离子浓度，减少酶用量，重新设计引物3、扩增效率过高或过低：降低模板用量，重新稀释标准品，注意加样操作4、

15、R2值过低：重新稀释标准品，注意加样操作5、污染发生：更换模板和实验用具知识点10：1、由于该物质不被色谱柱吸附或溶解，因此死时间可以被用来测定流动相的平均线速度2、相对保留值只与柱温和固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况和流动相流速无关，因此是色谱分析方法中广泛使用的定性依据3、速率理论式中 H为板高，u 为流动相线速度，A, B, C分别为涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力扩散项系数4、分离度又叫分辨率，是相邻两组分(A和B)色谱峰保留值之差的两倍与两组分色谱峰底宽之和的比值，即知识点11：色谱方法的选择根据样品物理、化学性质选择色谱方法；各种气体、沸点5000C以下挥发性、热稳

16、定的样品，一般采用气相色谱分析；非挥发性样品，包括有机物、无机物、高分子化合物等均可采用液相色谱分析。知识点12：正相色谱法：流动相极性小于固定相极性，即亲水的固定相选用疏水的流动相；在正相色谱法中：极性小的组分，保留时间短，先出峰；极性大的组分，保留时间长，后出峰。反相色谱法：流动相极性大于固定相极性，即疏水的固定相选用亲水的流动相；在反相色谱法中：极性大的组分，保留时间短，先出峰；极性小的组分，保留时间长，后出峰知识点13：离子交换原理离子交换色谱法是利用不同离子对离子交换剂的亲和力差异实现分离；离子交换剂一般采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和游离的平衡离子，分析物质电离后产

17、生的离子可与树脂上游离的平衡离子进行可逆交换；根据交换的对象，可分为阳离子交换树脂(带负电荷)和阴离子交换树脂(带正电荷)，它们各自的交换反应过程分别如下：阳离子交换：阴离子交换：如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值PH视情况不同而定，增大pH值会使酸的解离增加，使碱的解离减少；降低pH值，其结果相反；对于单纯的酸或碱，只要解离增加，就可以增大保留值；对于两性电解质，情况则要复杂一些蛋白质离子交换色谱蛋白质的等电点(isoelectric point IP)蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零时，溶液对应的 pH 称该蛋白质等电点对于中性pH下

18、，某种带有正电荷的蛋白质，可通过阳离子交换色谱进行纯化，知识点14：尺寸排阻色谱原 理：组分中，尺寸(流体力学体积)较大的分子由于不能进入凝胶颗粒的内部，而只能通过凝胶颗粒之间的缝隙，因此保留时间最短，最先流出；尺寸中等的组分，可以进入较大的凝胶颗粒的内部，同时经过凝胶颗粒之间的缝隙，因此，保留时间较长，相对于大尺寸组分，后流出；尺寸最小的组分，可以进入所有凝胶颗粒的内部，并经过凝胶颗粒之间的缝隙，所经过路径最长，因此，保留时间最长，最后流出；此外，形状规则的分子比形状不规则的分子先流出尺寸排阻色谱的特点：1. 由于溶剂分子非常小，在绝大多数情况下，可被认为是试样中尺寸最小的组分，因此，最后流

19、出这样试样中的待分离组分的保留时间均小于死时间，这与其他色谱是完全相反的；2. 组分不是通过两相之间的作用力差异来进行分离，而是按照组分的大小和形状进行分离知识点15：亲和色谱亲和色谱是利用生物分子和固定相表面存在的某种特异性的靶向性和亲和力，进行选择性分离的一种方法固定相：通常是在担体表面键合具有生物识别能力的生物分子(配体)，担体如果是凝胶，还可以实现“亲和尺寸排阻”双重作用流动相：一般选择离子强度较小、pH接近中性的缓冲液分离原理：组分首先与固定相上键合的配体进行作用，能够与配体进行特异性识别和相互作用的组分将被保留，而不能作用的组分则先被洗脱，然后通过高盐或者可溶性配体对与配体结合的组

20、分进行洗脱，因此存在如下关系：不能与配体发生特异性亲和作用的组分：保留值小，先出峰；能够与配体发生特异性亲和作用的组分：保留值大，后出峰；常用的亲和识别对包括：抗原抗体；生物素(biotin)链合亲霉素(SA)；组氨酸镍；酶底物(如，谷胱甘肽S转移酶谷胱甘肽)；钙钙调蛋白等知识点16：数值孔径又称为(numerical aperture NA)，是物镜前透镜与被检测物体之间介质的折射率()和孔径角()半数的正弦之乘积，用公式表示如下：显微镜的有效放大倍数取决于其NA的大小，一般是NA的5001000 倍；可见，提高NA，可以提高有效放大倍数；焦深与放大率和NA成反比；NA越大，焦深越浅NA大的

21、物镜，工作距离小，这是因为相应的孔径角较大视场直径与视场数成正比，与物镜倍率成反比前向散射(FSC)也称小角散射，该值的大小与细胞的直径成近似线性关系，即细胞尺寸越大，其FSC越大，反之亦然侧向散射(SSC)也称90散射，它对细胞膜、胞质和核膜的折射更加敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似线性关系，即细胞内部颗粒结构越复杂、质量越大，其SSC越大，反之亦然计算题离心力与转速的换算：离心力： F m2r 习惯上F常以相对离心力(RCF)的大小来衡量：RCF m2r /mg 2r /g g980cm/s将上式中角速度用转速n (rpm；r/min)来表示： 2n/60 则 RCF (

22、2n/60) 2r /g 1.11910-5n2r ( 单位:g)例如：文献中报道，对某样品的离心使用半径为23.5 cm的转头，12,000 r/min离心30 min可获得较好的离心结果，但是你的实验室中只有25 cm转头，请问如何重复出文献中的离心效果？RCF 1.11910-5n2rRCF 3, 7866.96 g2、3、塔板理论如果色谱柱长度为 L，理论塔板数用n表示，则柱长度、理论塔板高度、理论塔板数的关系如下：但是，在上述公式中，由于死时间 tM 包括在保留时间 tR 内，但是流动相并不参与两相分配过程，计算出的理论塔板数比实际偏高，因此提出将死时间 tM 扣除，再来计算有效塔板

23、数论述题朗伯比尔定律：当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程成正比关系。AlgT= bc : 摩尔吸光系数 表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度，单位： (Lmol-1 cm-1) A=lg (I0 / It ) lgT T = It / I0 朗伯比尔定律的局限性：比尔定律本身的局限性 比尔定律只适用于稀溶液，这是该定律的最主要限定条件浓度过大，吸收组分的平均距离减小，以致每个粒子都会影响其相邻粒子的电荷分布，导致发生改变，吸光度和浓度关系偏离比尔定律2）化学偏离 比尔定律成立的条件之二：测试体系中无发射、散射或光化学反应，即溶液中存在着

24、离解、聚合、互变异构等化学平衡时，会导致溶液浓度发生变化，影响吸光度与浓度的线性关系。3）仪器偏离 比尔定律成立的条件之三： 平行单色光，即只有采用真正的单色辐射，才能观测到吸收体系严格遵守比尔定律 当仪器单色光不纯引起的偏离，事实上，通过波长选择器从连续光源中分离出的波长，只是包括所需波长的波长带，即从连续光源中获得单一波长的纯单色光是很难办到的4）非均相体系偏离 比尔定律成立的条件之四：均相体系(真溶液 非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯，偏离比尔定律2、三种类型光谱仪的结构、光路、优缺点：（不是重点） 1）单光束分光光度计：从单色器中分离得到的

25、单一光束轮流通过参比溶液和试样溶液进行吸光度测量优点：结构简单；价格低廉；容易维修缺点：受光源、检测器波动的影响；不能自动记录吸收光谱应用范围：常规分析 2）双光束分光光度计：从单色器中分离得到的光束经过分光镜分为两束光，并分别同时通过参比溶液和试样溶液，最后再通过另一组反射镜和分光镜进入检测器进行检测优点：能自动记录吸收光谱（自动扫描）；不受光源和检测器的波动不影响(不断通过参比校正误差)；是目前用得最多的分光光度计缺点：无应用范围：最为广泛 3）双波长分光光度计：从光源发出的光被分为两束，并分别进入两个单色器，从而同时得到两束不同波长的单色光，再经过切光器使这两束单色光交替通过同一样品池，

26、并检测两波长处的吸光度差值，当两个波长保持1-2 nm间隔，并同时扫描时，将得到吸光度对波长的变化率曲线，即导数吸收光谱曲线。优点：更高的分辨能力，可以测定较高浓度的样品溶液，不受光源和检测器波动的影响，可以扣除背景吸收缺点：价格昂贵应用范围：多组分混合物或透明性较差的生物样品分析。3、荧光光谱的基本过程基本过程及机理：分子荧光、磷光产生以电子能级间的跃迁为基础分子被激发到S1以上的不同振动能级，处于这种激发态的分子不稳定，其电子很快发生振动弛豫，衰变到到同一电子态的最低振动能级如果分子被激发到S2以上的不同振动能级，则发生S2到S1的内转化(S2 到S1)和振动弛豫而衰变到S1的最低振动能级

27、，接着，有如下几种途径衰变到基态： 1）S1 S0 的辐射跃迁而发射荧光 (10-710-9s) 2）S1 S0 的非辐射跃迁，即内转换 (不发光) 3） S1 T1的非辐射跃迁，即系间窜越，接着发生T1 S0的辐射跃迁而发射磷光 (10-410s)4）S1 T1的系间窜越，接着发生TIS1的热活化，最后通过S1 S0的辐射跃迁而发射迟滞荧光。发射光谱的特征：斯托克斯位移：荧光波长总是大于激发光波长斯托克斯位移的产生说明了在激发和发射之间存在一定的能量损失，其产生的原因在于：a分子在发射荧光之前，很快经历了振动弛豫和(或)内转化，而损失部分激发能，只是发射相对激发有第一定的能量损失 (主要原因

28、) b辐射跃迁可能只使激发态分子衰变到基态的不同振动能级，然后通过基态的振动弛豫进一步损失能量 c溶剂效应，比如极性溶剂会使激发态能量降低发射光谱的形状通常与激发光波长无关：发射光谱通常只含有一个发射带发射光谱与吸收光谱呈镜像对称的关系，荧光发射是光吸收的逆过程6、荧光量子产率( Yf )：荧光物质吸收光后，所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数的比值荧光量子产率的大小取决于物质的化学结构和实际测定的溶液环境，但通常不随激发光波长而改变，因此，可以用来反应荧光物质的荧光性能荧光量子产率越大，单位浓度的荧光物质的荧光强度越大，荧光性能更加优越影响荧光的因素有：其特定分子的结构，测试溶液性质

29、包括PH值，温度等结构因素包括：1）随着电子共轭度的加大和分子平面度的增加，荧光效率也增大随着卤素取代基卤素原子序数增加而荧光下降，原因是“重原子效应”导致系间窜越几率增大；环境因素包括：1）荧光波长随着溶剂极性的增大而红移，荧光强度增强溶剂粘度减小或温度升高，增加荧光分子相互碰撞的机会，导致非辐射跃迁的几率增加，而使荧光效率下降PH值：每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围，荧光物质本身是弱酸或弱碱时，PH值对荧光强度有较大的影响。荧光淬灭的几种方式：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用而引起的荧光量子产率降低的作用常见的荧光猝灭剂：分子氧，能引起几乎

30、所有荧光物质产生不同程度的荧光猝灭；胺类物质，大多数未取代芳烃的有效猝灭剂；卤素化合物，对奎宁的荧光有显著的猝灭作用重金属离子；硝基化合物等淬灭方式动态淬灭：淬灭剂与荧光物质的激发态分子之间的相互作用，激发态的荧光分子与淬灭剂发生碰撞后，将激发能转化为热能，便使激发态分子以非辐射跃迁的方式回到基态，影响荧光分子的激发态寿命，而不改变其吸收光谱，温度升高，淬灭增强静态淬灭：淬灭剂与荧光物质的基态分子之间相互作用，形成不发光的配合物，不影响荧光分子的激发态寿命，涉及吸收光谱发生改变，温度升高，淬灭减弱能量转移，也属于动态淬灭，淬灭剂与受激发的荧光分子相互作用后，发生能量转移，使得淬灭剂得到激发氧的

31、淬灭：氧存在的情况下，增强了荧光物质激发态分子的S1T1的系间窜越，随着溶剂介电常数的减小而增加自淬灭和自吸收：由于激发态分子之间的相互碰撞产生能量损失，所以当荧光物质浓度较大时，会发生自淬灭现象；当荧光物质的吸收光谱和发射光谱重叠严重时，荧光被溶液中处于基态的分子吸收，称为自吸收。动态猝灭(热能释放)；静态猝灭(形成不发光的配合物，涉及吸收光谱改变)能量转移(激发猝灭剂)；氧的猝灭作用自猝灭和自吸收；气相色谱的选择：在GC中，固定相可分为液体固定相(气-液色谱) 和 固体固定相(气-固色谱)，其中液体固定相应用更为广泛；气相色谱的应用范围GC可应用于分析气体试样，也可分析易挥发或可转化为易挥

32、发的液体和固体试样，不仅可以分析有机物，也可应用于无机物的分析；一般来说，只要沸点在500 以下，热稳定性良好的物质，原则上都可采用GC进行分离和分析；然而对于难挥发和热不稳定的物质，GC一般不再适用，但是近年来，裂解GC(将大分子量的物质在高温下裂解为易挥发的小分子，然后通过GC进行分析)、反应GC(通过适当化学反应将难挥发物质转化为易挥发物质，然后通过GC进行分析)的应用，扩展了GC的应用范围气相色谱分离中，欲使色谱峰宽减小，可采取以下措施：减小色谱柱长度，增加柱温、减小进样量，较小填料粒度9、HPLC 与 GC 的比较：(1) GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物

33、总数的20，对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析；(2) GC的流动相一般采用惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用；而HPLC的流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争；因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便(3) GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC则经常可在室温条件下工作；总之，高效液相色谱法是吸取了GC与经典LC优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展，目前高效液

34、相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的生物分子，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析根据样品物理、化学性质选择色谱方法；各种气体、沸点5000C以下挥发性、热稳定的样品，一般采用气相色谱分析；非挥发性样品，包括有机物、无机物、高分子化合物等均可采用液相色谱分析补充内容绪论 精密度 dr = s/ x dr :相对标准偏差(精确度)；s : 绝对标准偏差；X : n次测量的平均值 S ：绝对标准偏差n ：测量次数Xi：代表单次测量结果 X ：代表n次测量结果的平均值灵敏度检出限Sm = Sblank + k sb Sm = Sblank

35、+ 3sb仪器或方法的灵敏度越高，精密度越好，检出限就越低；一般用S/N来描述仪器的信噪比，多数情况下，N是恒定的，与S大小无关，当测量信号较小时，测量的相对误差将增加。 生物样品预制备沉降速度：指在离心力作用下，颗粒在单位时间内的运动距离差速离心：原理：差速离心是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的颗粒。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮颗粒，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。用差速离心分离法分离颗粒不仅取决于颗粒的质量和形状而且也取决于颗粒的密度。离心开始时首先是质量最大颗粒的样品沉降,而且

36、在质量和密度相同的条件下,球体颗粒沉降速度要比形状不对称的颗粒快，如果质量相同而密度不同的颗粒,密度大的沉降得快。原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将具有不同颗粒性质的样品置于介质的顶部，通过离心力场的作用使样品分层、分离；该方法对密度介质的要求主要包括：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度适中；2）pH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对生物样品惰性；5）易于从介质中重新回收样品；6）在紫外区或近紫外区无吸收，常用的密度介质有：密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖、多聚蔗糖和硅胶颗粒等。光学分析导论与光谱法不同，非光谱法不涉及到能量跃迁，而是利用了光与物质

37、作用时所产生的反射、折射、干涉、衍射和偏振的变化来达到分析测试的目的；光谱法的定义：光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长和强度进行分析的方法单色器也称为分光系统，可将由不同波长的“复合光”分开为一系列“单一”波长的“单色光”的器件；理想的100%的单色光是不可能达到的，实际上只能获得的是具有一定“纯度”的单色光，即该单色光具有一定的宽度(有效带宽)；有效带宽越小，分析的灵敏度越高，选择性越好，分析物浓度与光学响应信号的线性相关性也越好狭缝宽度的选择原则*定性分析：选择较窄的狭缝宽度可提高分辨率，减少其它谱线的干扰，提高选择性；定

38、量分析：选择较宽的狭缝宽度可增加光强度，提高分析的灵敏度；应根据实验对象和分析要求确定狭缝宽度，并通过条件优化确定最佳狭缝宽度，如选择光谱半峰宽的十分之一可以兼顾灵敏度和光强度 原子吸收光谱测定对象：定物质中某种元素的存在和含量同一周期：从左到右，原子半径逐渐减小，原子核对价电子束缚增加，所需激发能越来越高同一主族：自上而下，所需激发能越来越低AAS是应用广泛的微量金属和非金属元素的首选测定方法线光谱 (Line spectra) 由处于气相的单个原子发生电子能级跃迁所产生的锐线；例 如：钠原子基态的光谱项是： 32S1/2 第一激发态的光谱项是：32P1/2与32P3/2其中：主量子数变化：

39、n = 3-3 =0； 总角量子数变化：L = P - S =1； 总自旋量子数变化： S = (2s-1) (2s-1) =0； 内量子数变化： J = 1/2 1/2 = 0 or 3/2 1/2 = 1钠原子第二激发态的光谱项为：32D3/2 与 32D5/2当电子在3p与3d之间跃迁时，有四种可能的跃迁：32P1/2-32D5/2、32P1/2-32D3/2、32P3/2-32D5/2、32P3/2-32D3/2实际上只观察到后三种跃迁，因第一种跃迁J=2，是禁戒的光源应满足如下要求：（1）光源的带宽比吸收峰的宽度窄，才能满足比尔定律的浓度和吸光度的线性关系；因此，在原子吸收光谱中不能

40、使用连续光源的激发模式；（2）根据气态自由原子对同种原子辐射的特征谱线产生自吸的现象，应该使用待测元素的共振线作为辐射源；（3）辐射光强度大，稳定性好；（4）光源温度低于原子化温度，防止多普勒变宽火焰的类型化学计量火焰：燃气与助燃气的比例与它们之间的化学反应计量关系相近；特点：温度高，干扰少，稳定，背景低，常用；富燃火焰：燃气与助燃气的比例大于化学计量关系特点：还原性火焰，燃烧不完全，适用于测定易形成氧化物的元素，如：铁、钴和镍等；贫燃火焰：燃气与助燃气的比例小于化学计量关系特点：火焰温度低，氧化性气氛，适用于测定易解离的元素，如：碱性金属测定1 优点 (1) 检出限低、灵敏度高 20种元素优

41、于AAS (2) 谱线简单、干扰小(3) 线性范围宽（可达35个数量级） (4) 易实现多元素同时测定（产生的荧光向各个方向发射）缺点 存在荧光淬灭效应、散射光干扰等问题；三种类型：共振荧光、非共振荧光与敏化荧光共振荧光：气态原子吸收共振线被激发后，激发态原子再发射出与共振线波长相同的荧光；非共振荧光：当荧光与激发光的波长不相同时，产生非共振荧光；分为：直跃线荧光、阶跃线荧光、anti-Stokes荧光三种； 原子发射光谱1原子发射光谱(AES;)：是依据每种化学元素的原子或离子在热激发或电激发下，发射特征的电磁辐射，而进行元素定性、半定量和定量分析的方法，它是光学分析法中产生与发展最早的一种

42、分析方法定性分析由于待测原子的结构不同，因此发射谱线特征不同定量分析由于待测原子的浓度不同，因此发射强度不同2在原理上，AES与AAS的区别：测定发射；AES与AFS的区别：激发方式不同，AES属于热致激发或者电致激发，而AFS属于光致激发；但都是线光谱3AES特点;多元素同时检测能力；分析速度快；选择性好，能产生很多光谱线，定性分析很有优势，但是由于谱线干扰增加了定量分析的难度，因此需要高分辨仪器；检出限较低，一般光源可达ug/mL，如采用电感耦合等离子体（ICP）作为光源，则可降低至 ng/mL；精密度好，一般光源为10%左右，线性范围约2个数量级。 ICP精密度达到1%以下，线性范围可延长至7个数量级，这种方法可有效地用于同时测量高、中、低含量的元素；试样消耗少；非金属元素测定困难4 在AES中，光源具有使试样蒸发、解离、原子化、激发、跃迁产生光辐射的作用；一般光源可达ug/mL，如采用电感耦合等离子体（ICP）作为光源，则可降低至 ng/mL；目前常用的光源有直流电弧、交流电弧、电火花及电感耦合等离子体(ICP)；紫外吸收光谱 * 跃迁和n *是有机化合物电子跃迁和紫外 可见吸收的最重要的两种形式荧光PCRA PCR原理：以DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的条件下，利用耐热DNA聚合酶进行互补链的