DNA连接反应的步骤及说明

1、快速DNA连接试剂盒概述：克隆中两个重要步骤包括外源DNA与载体的连接和重组DNA的转化。连 接反应是通过连接酶完成的，连接反应需要ATP和镁离子催化双链DNA的 3 -OH和5 -P形成磷酸二酯键。DNA末端可以是 粘末端，也可以是平末端。 粘末端连接反应效率高于平末端连接效率。因此，在连接平末端分子时DNA浓 度要高于粘末端分子连接反应的DNA浓度。PEG可以使T4 DNA连接酶对平末端 和粘末端连接效率得到提高Pheiffer, B.H., Zimmerman, S.B., Nucleic Acids Res., 11, 7853-7871, 1983。由于PEG可以辅助提高连接效率，该

2、试 剂盒对于粘末端和平末端的连接只需十分钟即可完成。试剂盒中提供独特的 5XRapid Ligation Buffe，专为提高DNA连接效率设计。高的PEG浓度可以提 高连接反应效率但却会使转化效率 降低，因此应该对PEG浓度进行优化。该试 剂盒中优化的PEG浓度同时保证了高的连接效率和转化效率。目录号规格价格LINK-3030 次180 元保存：试剂盒中所有组分需-20C保存。请不要用其它试剂替代该试剂盒中的反应缓 冲液。试剂盒包装组成：该试剂盒中提供的试剂可以完成30X20 ul DNA连接反应。试剂盒组成规格(30reactions )T4 DNA ligase30ul5XRapid L

3、igation Buffer(5x RLB)200 Ul特点：室温(20-25C)连接 10-30 min。存储缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)50 mM KCl1 mM Dithiothreitol50% Glycerol质量控制：试剂盒中提供的T4 DNA连接酶没有检测到外切核酸酶或内切核酸酶活性。 另外每一批连接酶都通 过SDS聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白污染(低于5%)。核酸外切酶污染检验T4 DNA连接酶与1mg经超声波处理的3H标记的E.coli DNA (105cpm/mg)在50ml反应体系中，采 用随酶提供的Rapid Ligation Buffer，37C温

4、育4小时。通过三氯乙酸(TCA)沉淀DNA,然后计算上清 液的放射活性。 通过计算上清液中被标记的总DNA放射活性，进而可以显示出核酸外切酶活性。 检测出外切酶活性低于0.1放射活性，这种方法可检测出的底线是0.05%。核酸内切酶检测 在50ul反应体系里,T4DNA连接酶与1 mg超螺旋质粒DNA37C 温育4小时，用琼脂糖凝胶电泳 检测，只有0.1%转变为缺口或线性质粒DNA。操作步骤：DNA片段克隆到质粒载体上我们推荐载体与插入DNA的摩尔数比例为1:1或1:3。最佳的摩尔数比例因载 体类型的不同而不同，例如cDNA和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算 插入DNA用量：(ng of

5、 vector) x (kbp size o-f ins-ert), Insert,kbp size of vector: x molar ratio of = rtq of nv-ector实例:载体与插入片段的摩尔数比例为1:3,如连接反应中加入100ng 6kb载体， 插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：x=25 皿16kbp size of vector(10Ong v-ector) x (O.5kbp size of insert)在一个PCR薄壁管中加入下列成份:100ng25ng4ul1ul至 20ul载体DNA 插入DNA 5XRLBT4DNA连接酶 ddH2O

6、室温温育十分钟将连接反应液与感受态细胞做转化。(感受态效率：1X107)线性DNA重新环化：在重新环化反应中DNA的量十分重要。同DNA片段克隆到载体相比，较 低的DNA浓度有利于增强重新环化，因为低的DNA浓度有利于分子内部的连接 (重新环化)，而抑制分子之间的连接。实例:在一个PCR薄壁管中加入下列成份：载体 DNA2030ng5XRLB4ulT4 DNA连接酶1ulddH2O至 20ul室温温育十分钟。将连接反应液与感受态细胞做转化。（感受态效率：1X107）接头连接反应：接头（8个碱基或者更长）连接反应条件同DNA片段与质粒载体连接相同。但是如果接头的长度小于8个碱基或者GC含量较低，

7、那么连接反应 应该在16C 进行30分钟到2小时。我们推荐载体/接头摩尔比为：脱磷酸化载体：磷酸 化接头1:100实例:在一个PCR薄壁管中加入下列成份：DNA 片段100ng接头25ng5XRLB4ulT4 DNA连接酶 1ulddH2O至 20ul16C温育1小时将连接反应液与感受态细胞做转化。（感受态效率：1X107）在接头连接反应中70C十分钟可以使T4 DNA连 接酶失活，可根据试验情况进 行纯化。问题与建议：影响连接反应的因素很多，例如：连接反应本身、感受态细胞、媒介选择、 限制性内切酶对载体的消化能力、磷酸酶与载体的相互作用等。由于连接反应中 的组分对感受态细胞的抑制作用，因此在

8、做转化之前应该对反应稀释5倍。下 表列出了一些可能引起连接失败的原因及建议。可能原因建议解决方法在DNA中存在连接酶抑制物纯化DNA，用酚抽提并且乙醇沉淀DNA连接酶失活更换新的T4 DNA连接酶反应缓冲液中ATP降解请于24个月内使用5XRapid LigationBuffer并于-20C储存限制性内切酶的存在导致连接产物被通过酚抽提并且乙醇沉淀去除限制性内切酶或者热再次消化失活内切酶反应物中DNA被非特异性核酸内切酶降解尽量使用新的试剂，水要高压灭菌实验信息：1.连接效率粘末端DNA连接反应（EcoR I）平末端DNA连接反应（Sma I）粘末端DNA连接凌应（EcoR 平末端DNA连接反应（导版I葵旅200%忑 15050能图1，以上两图为A公司的快速DNA连接试剂盒与SBS Genetech快 速DNA连接试剂盒的试验对比。无论粘末端还是平末端SBS Genetech试剂盒的 连接效率均大于A公司。2.长插入片断的连接对于长度为广2kb的插入片段，我们推荐在室温（20-25C）下做连接，连 接反应不超过30分钟。虽然长