动物产品中微生物检测技术-PHPppt课件

1、动物产品中微生物检测技术王 娟中国动物卫生与流行病学中心2021-3-11.内容沙门氏菌金黄色葡萄球菌O157H7单核增生性李斯特氏菌存在问题.沙门氏菌.DANIEL ELMER SALMON, (1850-1914)美国兽医微生物和病理学家。是美国授予的第一位兽医学博士。1884年任美国农业部畜牧局 首任局长。他初次从病猪中分别出猪霍乱沙门氏菌。在医学微生物中通用的沙门菌一词，就是为留念他而以 他的名字命名的。沙门氏菌Salmonella.沙门菌Salmonella 沙门菌属Salmonella是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反响和抗原构造类似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。. 大小0.6

2、1.023um，无芽胞，普通有鞭毛(鸡沙门菌除外)，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为3537，最适pH值为6.87.8。沙门氏菌生物学性状.不分解乳糖亚利桑那菌除外。分解葡萄糖产酸产气伤寒沙门菌产酸不产气。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能复原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培育基上不生长。 沙门菌生物学性状.国内外沙门菌检测方法传统方法 国家规范 GB/T 4789.4-2003行业规范FDA Food & Drug Administration AOAC (Association of Officia

3、l Analytical Chemists) FSIS FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE ISO加拿大官方食品微生物分析方法 .冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25gBPW225mL36 1 普通4h，干蛋品18h24h10mLMM或TTB100mL10mLSC100mL直接增菌法25g灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL MM或TTB100mL检样匀液25mL SC100mLBSDHL或HE、WS、SSTSI排除A/A H2S结果 ，靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学实验甘露醇 山梨醇H2S 靛 尿KCN

4、赖H2S 靛 尿KCN 赖/非如左述的各种反响结果沙门氏菌血清学实验 ONPG 沙门氏菌非沙门氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18h24h36 1 40h48h36 1 18h24h 微生物学检验 沙门氏菌检验中华人民共和国国家规范GB/T 4789.4-2003. 出口食品沙门氏菌属包括亚利桑那菌检验方法 肉类、蛋品缓冲胨水BPW四硫磺酸盐煌绿TTB亚硒酸盐胱氨酸SC37 4h or 2024h直接选择性增菌亚硒酸盐胱氨酸SC 四硫磺酸盐煌绿TTB37 24 2h BS & DHL (亚利桑那菌琼脂) 前增菌37 2448h TSI & 赖氨酸脱羧酶T

5、SI & 尿素酶 37 2448h生化实验血清学实验“O抗原，“Vi抗原 42 20 2h 37 2448h结果断定检验检疫行业规范SN 017092. 样品25g225mL 乳糖肉汤LBor 胰酪胨大豆肉汤 TSBor 煌绿溶液 BGor通用前增菌肉汤UPBor营养肉汤NBor 再造脱脂奶粉 or 四硫酸盐煌绿TTpH6.80.2 242 h 35RVTT 430.2 or 352.0 242h 242h 420.2BS & XLD & HE 242h 35TSI & LIA非沙门菌沙门菌非沙门菌LIA+LIA TSI K/ALIA TSI A/A &尿素酶，H抗原多价H抗血清或Spicer

6、-Edwards flagellar (H) test ，赖氨酸脱羧酶，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤KCN，丙二酸盐，吲哚，O抗原酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MRVP,西蒙氏柠檬酸盐5种商业生化鉴定系统API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI&O抗原&H抗原细菌学分析手册FDA/BAM第五章 沙门氏菌属.肉、禽和蛋品中沙门菌的分别和鉴定USDA/FSIS MLG 4.02样品BPW or BPW含结晶紫351 20-24hBGS & DMLIA or XLT442 0.5 2224h0.5 0.05m

7、L10mL TT0.1 0.02mL10mL mRV42 0.5 2224h35 1 1824h & 48hTSI & LIA血清学实验商业生化试剂盒或自动鉴定系统 or传统生化鉴定AOAC Official Method 967.27 or Edwards and Ewings Identification of Enterobacteriaceae报告结果. 肉制品中沙门菌的分别和鉴定 FDA&USDA/FSIS乳糖肉汤缓冲蛋白胨水TTB肉汤RV肉汤TTB肉汤RV肉汤BSXLDHEXLT42倍改良LIABGS生化挑选 LIA,TSI 鉴定及确证实验 葡萄糖 脲酶实验 卫矛醇 动力实验 吲哚

8、 MR-VP测试 氰化钾 粉红酒石酸盐琼脂 乳糖 水杨苷 赖氨酸脱羧酶 西蒙氏枸橼酸盐 丙二酸 蔗糖血清学实验.AOAC沙门菌检测方法AOAC Official Method 967.25Salmonella in FoodsPreparation of Culture Media and ReagentsAOAC Official Method 967.26Salmonella in Processed FoodsDetectionAOAC Official Method 967.27Salmonella in FoodsIdentificationAOAC Official Method

9、967.28Salmonella in FoodsSerological Tests.食品中的沙门菌检测方法AOAC 967.25967.28处置样品1mL+10mLSC1mL+10mLTT35 242hXLD & HE & BS35 242hBS 24h&48h35 242hTSI & LIA35 242h纯培育物不纯培育物纯培育物MAC or XLD or HE尿素酶尿素酶非沙门菌H抗原，LIA，酚红卫矛醇肉汤，色氨酸肉汤KCN，丙二酸盐，吲哚，O抗原吲哚 & H血清KCN & LIA非沙门菌非沙门菌补充生化实验酚红乳糖肉汤，酚红蔗糖肉汤，MRVP,西蒙氏柠檬酸盐非沙门菌沙门菌.25g样品

10、225mL BPW35 or 37 1620 h0.1mL+10mL RV10mL+100mL SC42 24h35 or 37 24h&48h酚红煌绿琼脂 亮绿琼脂 & 第二种选择性平板35 or 37 2024h无典型菌落再培育1824h典型菌落pink red营养琼脂纯化可疑菌落每个平板选5个菌落35 or 37 1824hTSI，尿素酶，赖氨酸脱羧酶，ONPG，VP，吲哚血清学实验O抗原，Vi抗原，H抗原报告结果送参考实验室ISO 6579:1993(E) 微生物沙门菌检测的通用方法.25g样品营养肉汤or缓冲胨水or煌绿 水溶液or胰蛋白酶大豆肉汤35 1824 h1mL+9mL S

11、C1mL+9mL TBG35 242h42.5 242hBS & BGS35 242h & 48 2h纯培育物不纯培育物纯培育物MACTSI &LIA&尿素琼脂O多价血清，H多价血清食品中沙门菌的分别和鉴定加拿大HPB方法商业生化试剂盒或自动鉴定系统报告MFHPB-20.判别规范国标、无公害食品规范、绿色食品规范：沙门氏菌不得检出未检出/25g。美国规范中规定： 沙门氏菌最大检出数小公牛/小母牛：1/82；母牛/公牛：2/58； 碎牛肉5/53；嫩鸡12/51；猪6/55；碎火鸡肉29/53；碎鸡肉26/53。.沙门氏菌的危害 据美国疾病控制中心报告，沙门氏菌是美国食物中毒致死的主要缘由，每年

12、全国大约报告40000例沙门氏菌感染病例，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。日本厚生省统计，在发生的670起细菌性食物中毒中，沙门氏菌占62起，排在第三位，中毒人数为2045人。有些国家，沙门氏菌食物中毒占细菌性食物中毒的40% - 60%以上。我国以沙门氏菌引起的细菌性食物中毒占首位。世界上最大的一同沙门氏菌食物中毒事件发生在1953年，瑞典人由于食用了被鼠伤寒杆菌污染的猪肉引起的中毒，中毒7717人，死亡90人。1972年青海市同仁县因圣保罗沙门氏菌污染牛肉引起的中毒事件，中毒1041人。沙门氏菌食物污染给国家呵斥宏大的经济损失，如1990年在向欧洲出口的生肉中检测到

13、肠炎沙门氏菌，全部销毁的直接经济损失达3000万元。.OIE法典2007年召开的陆生动物规范法典委员会会议上制定了许多国家曾经采取了沙门氏菌控制措施，并获得了良好的社会效益和经济效益。.我国的沙门氏菌防控措施生鲜畜禽肉中的沙门氏菌污染情况养殖场中安康动物带菌情况养殖场环境中的沙门氏菌情况.动物产品中沙门氏菌污染.养殖场环境污染空气、水源、饲料、土壤. 金黄色葡萄球菌.生物学特性-菌体形状及培育特征革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规那么的簇群；无芽孢，不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长.分布在自然界中广泛存在，空气、

14、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上安康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因此，食品受其污染的时机很多。传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20-22放置5小时以上时，病菌大量繁衍，并产生肠毒素。 .致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎病症，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相

15、当数量的肠毒素。. 微生物学检验 金黄色葡萄球菌菌检验中华人民共和国国家规范GB/T 4789.4-200325g样品+ 225ml 生理盐水 5mL样品匀液1:10+ 50mL胰酪胨大豆肉汤血平板36 1 24hr 镜 检血浆凝固酶实验 报告结果 36 1 24hr 36 1 24hr 36 1 6hr BP平板定性检测. 微生物学检验 金黄色葡萄球菌菌检验中华人民共和国国家规范GB/T 4789.4-2003定量检测平板法25g样品+ 225ml 生理盐水 选三个延续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至外表枯燥的BP平板如0.4mL，0.3mL，0.3mL平板计数分别记录每种类型的菌落数36

16、 1 48hr 镜 检 营养肉汤血浆凝固酶实验 报告结果 金葡菌数/g(mL)每种类型至少选取一个菌落 36 1 24hr 36 1 6hr 梯度稀释 适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/gmL的食品.B-P平板.控制措施 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对消费加工人员进展安康检查，患部分化脓性感染如疥疮、手指化脓等、上呼吸道感染如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等的人员要暂时停顿其任务或互换岗位。对肉制品加工厂，患部分化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处置后进展加工消费。.防止带菌人群对各种食物的污染：定期对消费加工人员进展安康检查，患部分化脓性感染如疥疮、手指化脓等、

17、上呼吸道感染如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等的人员要暂时停顿其任务或互换岗位。防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、细菌繁衍。奶制品要以消毒牛奶为原料，留意低温保管。.大肠杆菌O157H7.EHEC O157H7生物学特性EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力实验呈阳性。其鞭毛抗原可丧失，动力实验阴性。EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐

18、热，75 1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。EHEC 的最适生长温度为33-42，37繁衍迅速，44-45生长不良，45.5停顿生长。不能分解4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷MUG产生荧光，即MUG阴性。 .进出口肉及肉中肠出血性大肠杆菌O157H7检验方法检验检疫行业规范SN/T 0973-200025g样品+ 225ml EC肉汤 接种SMAC37 24h生化反响鉴定血清凝集鉴定 报告结果 或41 24h接种MUGLIST发酵管培育基37 24hEHEC乳胶凝集实验.EHEC O157 H7在显色培育基上.有很强的耐酸和耐低温才干，可以产生大量的Vero毒素。1982年

19、美国初次报道了由大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎迸发。日本在1996年和2001年发生的大肠杆菌 O157:H7的迸发流行，引起出血性腹泻，感染人数较多，并呵斥12人死亡，引起了全世界的关注。此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地域也相继报道了大肠杆菌O157:H7的分发性感染和迸发流行。日本、加拿大及瑞士等国已将大肠杆菌O157:H7列为必需报告的传染病，予以高度注重。我国于1988年初次分别到大肠杆菌O157:H7，从已有的流行病调查资料来看，我国亦存在大肠杆菌O157:H7的分发病例，但尚未有迸发流行的报道。O157H7的危害.我国动物产品中O157H7

20、的污染情况对市售生鲜猪肉和禽肉检测发现： 猪肉中均未发现O157H7； 有少部分禽肉污染O157H7。. 单核增生李斯特氏菌.单核细胞增生李斯特氏菌：是李斯特氏菌的其中一种。世界卫生组织WHO关于单核细胞增生李斯特氏菌食品中毒报告中指出， 5%10%的乳及乳制品均被该菌污染。由于该菌在4冰箱保管的食品中也能生长繁衍，使其危害性更进一步增大。根据记载，第一例确定由食品引起的李斯特菌感染是1981年发生在加拿大的一次较大规模的污染事件。在那次事件中，有41例被感染，7例致死。其后，在美国、瑞士、英国、法国又相继发生了李斯特菌的污染事件。牵涉到的食品有牛奶、乳酪、猪肉、生乳制品等。1983年6月在美

21、国的马萨诸塞州发生了由于饮用含有李斯特氏菌的巴氏消毒奶引起的食物中毒事件。李斯特菌的感染最近呈上升趋势。 .生物学特性-菌体形状及染色特征革兰氏阳性；小的、类似球形杆菌，0.40.50.52m，在有些培育基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行陈列，在较老的或生长不良的培育物中，能够构成丝状；20-25以4根周生鞭毛运动，在37只需较少的鞭毛或1根鞭毛；无芽孢、无荚膜。.流行病学据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪

22、尤其是软奶酪、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制造的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 .1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类来源：USDA及FDA报告.单核增生李斯特氏菌检测流程25g样品+225ml BLEB根底参与丙酮酸钠 参与萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮 30 4hr划线接种OXA平板30 24hr和48hr 科玛嘉李氏菌显色培育基TSA-YE分纯 35 24hr-48hr 35 24hr过氧化氢酶实验、革兰氏染色、溶血实验、糖发酵实验木糖、鼠李糖 API Listeria 35 24-48hr

23、报告结果 35 18-24hr.方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法SN 0184-1993加工MBP30，18-24hEB30，24/48hMMA/OXA（35，24-48h）蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30，24/48h）GB/T 4789.30-2003EB（301，48h）MMA（301，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、典型运动）；生化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同

24、溶血无LB1（301，24h）LB2（301，24h）FDABLEB+Phy（30，4h）BLEB+Phy+三种抑菌剂（30，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+推荐BCM /ALOA / RapidLmono /CHROMagar Listeria蓝色菌落*；典型运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、鉴定都可以使用快速方法USDAUVM（302，222h）FB（352，26-482h）MOX（352，26-482h）初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动；生化鉴定：MICRO-ID Listeria或Api Lister