20第20章自动化仪器分析ppt课件

1、第二十章 免疫检验自动化仪器分析第一节 自动化免疫浊度分析系统 一、免疫透射比浊法 二、免疫胶乳比浊法 三、免疫散射比浊法 四、免疫比浊分析的影响要素和临床运用.第四节 自动化酶联免疫分析系统第二节 自动化发光免疫分析系统 一、吖啶酯标志化学发光免疫分析仪 二、酶联发光免疫分析仪 三、 电化学发光免疫分析仪 四、在临床免疫检测中的运用第三节 自动化荧光免疫分析系统 一、时间分辨荧光免疫分析仪 二、荧光偏振免疫分析仪思索题小结. 免疫检验自动化 automation of immunoassays) 是将免疫学反响检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分别、信号检测、数据处置、打印报告和

2、检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进展。.第一节 自动化免疫浊度分析系统 免疫浊度分析的根本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反响，构成小分子免疫复合物19S，使反响液出现浊度。在抗体略微过量且固定的情况下，构成的免疫复合物量随抗原量的添加而添加，反响液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反响溶液的浊度呈正相关。 .一定波长的入射光线经过抗原抗体反响后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而构成的免疫复合物量与参与反响的抗原和抗体的量呈函数关系。与知浓度的抗原规范品比较，可确定标本中抗原含量。一、免疫透射比浊法一原理：. 1

3、.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。二仪器任务过程 2.将待测标本和规范抗原溶液5个浓度抗原规范品与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反响完成后，在340nm处测定各管吸光度。 3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进展曲线拟合，制备剂量-反响曲线，由计算机处置，计算出抗原浓度。.三方法评价 优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确 缺乏: 抗体用量较大； 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反响的第二阶段，检 测需在抗原抗体反响到达平衡后进展，耗时较长。 .用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒普通为0.2 m，在遇到相应抗

4、原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如下图：a为单个胶乳颗粒不妨碍光线透过，b为抗原抗体结合构成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光加强。 二、免疫胶乳比浊法一原理：.二方法评价 本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L程度，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段替代IgG既可消除此干扰，又可抑制IgG致敏胶乳的自凝景象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。. 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子遭到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而构

5、成散射光。悬浮微粒对光散射构成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、丈量角度等要素亲密相关，其公式如下：三、免疫散射比浊法(一) 原理. 式I 中为与入射光成角处散射光强度；和I0为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的间隔；为散射光与入射光的夹角散射夹角。II042dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24.定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，参与待测抗原，此时反响立刻开场，在反响的第一阶段，溶液中产生的散射光信号动摇较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射

6、比浊法是避开抗原抗体反响的不稳定阶段，即散射光信号在开场反响7.5s2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反响的最正确时段进展读数，将检测误差降到最低。 (二)定时散射比浊法fixed time nephelometry.1. 仪器测定技术要点 (1) 抗原抗体预反响阶段 (2) 反响阶段(3) 信号检测 .2. 抗原过量检测 (1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进展阈值限定 .定时散射比浊法测定原理表示图 .BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪.速率散射比浊法是抗原抗体结合反响的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反响在单位时间内构成免疫复合物的量不是免疫复合物累积的量，延续测定各时间

7、复合物构成的速率与其产生的散射光信号联络在一同，构成动态的速率散射比浊法，每项检测仅12min即可完成。 (三)速率散射比浊法rate nephelometry.仪器测定技术要点 开启机器，进展定标 反响阶段 抗原过量检测 .抗原抗体复合物构成的速率累计时间s构成IC总量速率累计时间s构成IC总量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20.抗原抗体反响速率的动态变化.IMMAGE全自动特定蛋白分析仪.(三)方法评价 散射比浊法是目前临床运用较多

8、的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精细等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价钱比较贵, 对抗体的质量要求很高。.1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的运用 一免疫比浊分析的影响要素 四、免疫比浊分析的影响要素和临床运用. 4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位 7.规范曲线制备与质量控制 .二临床运用 免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜

9、蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反响蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。 .第二节自动化学发光免疫分析系统自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反响系统、固相载体分别清洗系统、信号检测系统和计算机数据处置、控制系统组成。 .吖啶酯标志的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标志抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分别技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等一样。 一、吖啶酯标志化学发光免疫分析仪

10、.YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY顺磁性微粒表示图 磁微粒技术 磁微粒在电磁场中分别磁微粒标志抗体.发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标志物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后双抗体夹心法直接化学发光的机理1参与酸性H2O2pH10.仪器测定技术要点 抗原抗体结合 洗涤、分别 参与氧化剂发光 信号检测 . 吖啶酯标志化学发光免疫测定表示图 .ACS：180 SE和ACSCENTAUR化学发光免疫分析仪ACS：180 SEACSCENTAUR.ci8200i2000sr. 酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反响的酶来标志抗原或抗体，在抗原抗体

11、反响后，参与底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，经过光信号的强弱来进展被测物的定量。 常用的标志酶有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。 二、酶联发光免疫分析仪.该仪器采用辣根过氧化物酶HRP标志抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用加强剂使化学发光强度添加、时间延伸。辣根过氧化物酶标志的化学发光免疫分析仪.鲁米诺是一种复原剂，在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物激发态。它以光量子辐射方式前往基态时，发出微绿色可见光。.鲁米诺加强化学发光的原理.辣根过氧化物酶标志的化学发光免疫测定表示图 .Vitro

12、s ECi全自动加强化学发光酶免分析仪. 碱性磷酸酶标志的化学发光免疫分析仪 该仪器是以碱性磷酸酶标志抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进展测定的自动化仪器。.AMPPD发光反响原理表示图 .抗原抗体结合 洗涤、分别 参与AMPPD发光剂 信号检测 仪器测定技术要点 .碱性磷酸酶标志的化学发光免疫测定表示图 .Access全自动酶标志化学发光免疫分析仪.UniCelDxI 800.IMMULITE 2000型全自动酶标志化学发光免疫分析系统.三碱性磷酸酶标志的微粒子荧光免疫分析仪 该仪器以碱性磷酸酶标志抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体或抗原，以4-甲基伞型

13、酮磷酸盐4-MUP作为酶促反响的荧光基质底物，底物被酶水解后，脱磷酸根基团，构成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发光照射，发出450nm的荧光。 .4-甲基伞型酮磷酸盐4-MUP反响原理表示图 .仪器测定技术要点 抗原抗体结合 洗涤、分别 参与底物4-MUP 信号检测 .碱性磷酸酶标志的微粒子荧光免疫测定表示图.AXSYM全自动酶标志荧光免疫分析仪.AIA-1800型全自动酶标志荧光免疫分析仪. 电化学发光免疫分析ECLIA是一种在电极外表由电化学引发的特异性化学发光反响，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体

14、，用三联吡啶钌标志抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、继续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反响方式如夹心法、竞争法等。 三、 电化学发光免疫分析仪.三联吡啶钌Ru(bpy)3 2+分子构造图.电化学发光剂发光的反响原理 .磁性微粒直径2.8m，外表的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反响体系中，构成均一稳定的液相，在磁场中易于分别。.仪器测定技术要点 抗原抗体结合 电化学发光反响 光信号检测 检测终了 .电化学发光免疫测定表示图 .电化学发光免疫测定任务表示图.标志磁颗粒在电场中发光任务表示图.ELECSYS 2021型全

15、自动电化学发光免疫分析仪.Modular Analytics E 模块170型. 可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢目的和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学运用最为广泛的新技术。 四、在临床免疫检测中的运用.第三节 自动化荧光免疫分析系统 荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反响与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反响后能否需求进展固相分别，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。 . 时间分辨荧光免疫测定time resolved

16、 fluorescence immunoassay, TRFIA是以镧系元素标志抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，规范曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛运用。 一、时间分辨荧光免疫分析仪.Eu3+元素激发光谱和发射光谱之间的stokes位移 一、原理.时间分辨Eu3+元素荧光信号丈量表示图 .二仪器测定技术要点 抗原抗体结合 参与Eu3+螯合抗体 参与酸性加强液 4. 信号检测 .固相双抗体夹心TRFIA检测过程表示图 . 加强液(enhancement solution

17、)，使Eu3+抗体抗原复合物的PH值降低至23，以利于Eu3+从复合物上完全解离下来，游离的Eu3+为加强液中的另一种螯合剂所螯合，在协同剂等其它成分的作用下，与加强液中的-二酮体生成一个Eu3+在其内部的维护性胶态分子团，这是一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，它在紫外光的激发下发射很强的荧光，信号的加强效果可达上万倍，该技术运用了解离加强步骤，并且采用了前后两种不同的螯合剂，前一种用于Eu3+与抗体标志，后一种用于与解离下来的Eu3+螯合成新的强荧光发射分子，因此，又将该技术称为解离加强镧系元素荧光免疫(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmu

18、noassay, DELFIA) 三解离加强原理：.auto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统.1. TRFIA分析用的酸性加强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防尘。 2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动安装，但不同厂家消费的微孔板，所产生的荧光有很大差别，应选择运用。 四本卷须知.荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面

19、的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光 标志物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗原-抗体竞争反响原理，适用于小分子半抗原如药物浓度的检测。 二、荧光偏振免疫分析仪.光的本质是电滋波，光是各个方向电滋波的混合物，当光线经过偏振滤光片后，构成只需一个方向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光蓝色光，485nm激发后，可吸收光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量并发射出单一平面的偏振荧光绿色光，525nm550nm 。偏振荧光强度与荧光物质分子在液相中转动的速度呈反比，即分子大转动速度慢，荧光强度大，分子小转动速度快，荧光强度小。 (一) 原理.偏振光和偏振荧光发生表示图荧光偏

20、振免疫测定任务原理表示图.1. 抗原抗体反响 2.偏振荧光强度测定 二 仪器测定技术要点.1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标志的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等要素。2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进展预处置，除去干扰成分。 三本卷须知.第四节 自动化酶联免疫分析系统 根据全自动酶联免疫分析系统的处置方式，人们通常将全自动酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处置系统即全自动样本处置任务站和“后处置系统即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，运用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗

21、涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进展。.一仪器组成和性能1.条形码识别系统 2.样本架和加样系统 3.试剂架 4.温育系统 .5.液路系统 6.洗板系统 7. 酶标板读数仪 8.自动装载传送系统 9. 计算机管理和信息系统 .全自动酶免分析仪中的连体机是将样本处置任务站和全自动酶免分析仪结合起来，任务速度快，自动化程度高，适宜大批量样本的处置，如血站系统。分体机，由于它有一个独立的全自动样本处置站，加样速度快，适宜实验工程变化多、样本批量不等的临床实验室。 二仪器评价.采用流水线式操作.加样.洗板.1. 什么是免疫检验自动化？运用哪些技术？优点是什么？2. 免疫浊度分析的原理是什么？有哪些临床运用？3. 免疫胶乳比浊法和免疫散射比浊法的原理是什么？4. 定时散射比浊法和速率散射比浊法的测定原理，其抗原过量检测有什么不同点？5. 免疫比浊分析的影响要素有哪些？6. 吖啶酯标志的化学发光