培养标本处理

1、培养前标本处理篇培养前标本处理篇标本采集处理标本采集处理n血液培养相关问题血液培养相关问题n脑脊液相关问题n粪便相关问题n生殖道标本相关问题n脓,吸出液及组织标本相关问题n痰标本相关问题痰标本相关问题n咽标本相关问题n真菌培养相关问题n尿标本相关问题血培养血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以下菌应视为非病原菌以下菌应视为非病原菌(除非除非1次血培养分离出次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌：芽孢杆菌属、凝

2、固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌从两个独立的皮肤位点采血，每瓶从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集采集10ml#135C 空气中孵育空气中孵育5天天每天检查浊度并翻转培养瓶每天检查浊度并翻转培养瓶#2#318小时后传进行次代培养小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养行革兰染色和传代培养革兰阳性球菌革兰阳性球菌接种血接种血平皿奥普托欣试验平皿奥普托欣试验革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌接种血平皿和接种血平皿和麦康凯平皿麦康凯平皿革兰阴性双球菌或球杆革兰阴性双球菌或球杆菌菌接种巧克力平皿和接种巧克力平皿和血平皿血平皿CO2中孵育中孵育72h#

3、5#4将重要的革将重要的革兰染色结果兰染色结果尽快通知临尽快通知临床医生床医生对重要病原菌对重要病原菌进行鉴定进行鉴定和药敏试验和药敏试验#6例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎克雷伯菌例如：肺炎链球菌例如：肺炎链球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution血培养是诊断败血症最有价值的手段血培养是诊断败血症最有价值的手段败血症是一个非常严重的问题败血症是一个非常严重的问题.血液中的微生物在血液中的微生物在3分钟内到达每个器官分钟内到达每个器官.在死于败血症的患者中在死于败血症的患者中,尽管采用抗生素给与合适尽管采用抗生素给与合适的治疗，的治疗，

4、1/4的人死亡时，血中循环的微生物为的人死亡时，血中循环的微生物为10/cc或更少或更少 微生物或其产物在血液中引起疾病循环的循环的 CFU/ml vs. 病原体病原体成人成人 (12 岁岁): 1 CFU/ml金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 27%铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌55%大肠埃希菌大肠埃希菌62%其他菌种其他菌种40%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle.循环的循环的 CFU/ml vs. 病原体病原体儿童儿童: 5 CFU/ml任何病原体任何

5、病原体 19% 10 CFU/ml任何病原体任何病原体 27%新生儿新生儿: 4 CFU/ml大肠埃希菌大肠埃希菌 26%From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle, York Hosp., York, PA. 1 CFU/ml任何病原体任何病原体 42%用于培养的血液体积用于培养的血液体积 体重 磅 千克体积 (ml)/穿刺总量/2次穿刺1% 全血体积% 总血液体积199042204040 ml1-2%体积体积% 阳性血培养结果阳性血培养结果 vs. 采

6、集的套数采集的套数%99%89%80%真阳性真阳性20 ml/套套Mayo Clinic Study立即获得足够血液并且开始抗生素立即获得足够血液并且开始抗生素治疗治疗 从不同部位获得从不同部位获得2-3套血培养套血培养(40-60ml血血液液) 最好在最好在5分钟内采集分钟内采集#1#2采集血培养时间的重要性采集血培养时间的重要性9% +14% +9% +11% +发热高峰前发热高峰前12-2.5小时小时发热高峰前发热高峰前2.5-0.5小时小时发热高峰期间发热高峰期间发热高峰后发热高峰后1-12小时小时166 病人病人105 病人病人199 病人病人258 病人病人Thomson et a

7、l. 1991. ASCP. Mayo Clinic Study要学会导管相关感染的诊断要学会导管相关感染的诊断关键点关键点: 患者必须有菌血症患者必须有菌血症检测导管相关感染检测导管相关感染移走导管移走导管 Maki Roll (半定量半定量)超声波降解和稀释超声波降解和稀释 (定量定量)通过管腔抽吸通过管腔抽吸 (定量定量)保留导管保留导管管腔刷管腔刷定量培养定量培养 (CVC & 外周血外周血)达到阳性的时间达到阳性的时间 (CVC & 外周血外周血)两个血培养瓶必须同一时间抽取两个血培养瓶必须同一时间抽取CVC阳性报警时间阳性报警时间(TTP)比外周血快比外周血快 2

8、小小时时短期插管短期插管 81% 敏感性敏感性 & 92% 特异性特异性长期插管长期插管 93% 敏感性敏感性 & 75% 特异性特异性不需要拔掉导管不需要拔掉导管-阳性报警时间阳性报警时间Raad, I. et al. 2004. Ann. Int. Med. 140:18.6138 份即时血培养份即时血培养; 191份两个血培养瓶中鉴定的细菌相同份两个血培养瓶中鉴定的细菌相同 (25份不同份不同). 108 (1.8 %) 有导管相关性感染有导管相关性感染; 9.8% 仅仅只有仅仅只有CVC培养阳性培养阳性.Maki 滚动法滚动法导管尖阳性培养结果导管尖阳性培养结果1. 导

9、管血在外周血阳性之前导管血在外周血阳性之前2 小时小时内内阳性阳性 报告报告: CVC不可能是菌血症的来源不可能是菌血症的来源2.导管血在外周血阳性导管血在外周血阳性 2 小时之小时之前前阳性阳性 报告报告: CVC 可能是菌血症的来源可能是菌血症的来源3. 只有其中一瓶报警阳性只有其中一瓶报警阳性 (如果所有瓶子中的血量如果所有瓶子中的血量足够足够)报告报告: 可能污染可能污染; 患者无菌血症患者无菌血症根据阳性报警时间判读根据阳性报警时间判读污染细菌污染细菌血培养污染定义为在几次血培养中单个血培血培养污染定义为在几次血培养中单个血培养下列细菌阳性养下列细菌阳性:凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性

10、葡萄球菌棒状杆菌棒状杆菌 微球菌微球菌丙酸杆菌丙酸杆菌 芽孢杆菌芽孢杆菌血培养污染 vs. 皮肤消毒% 污染污染Studies from Baylor, Nashville, & France败血症败血症 vs. “污染的污染的” 血培养血培养%阳性阳性Mayo Clinic Study心内膜炎心内膜炎菌血症菌血症皮肤定植细菌皮肤定植细菌#血培养套数血培养套数脑脊液（脑脊液（CSF)培养培养主要病原菌：主要病原菌：B群群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2 2月月-2-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌最少最

11、少1ml，最佳，最佳5ml医生通过无菌皮肤医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和菌管中。第二管和第三管用于微生物第三管用于微生物学检测。学检测。# 11500g离心离心15分钟分钟（可能的话）（可能的话）# 2# 3用吸管吸去用吸管吸去上清，留下上清，留下1cc的脑脊液沉淀的脑脊液沉淀注意：不要倾倒注意：不要倾倒# 4滴一滴沉淀滴一滴沉淀于巧克力平皿和于巧克力平皿和血平皿血平皿上下吸取上下吸取10次以上次以上混匀沉淀混匀沉淀# 5CO2中孵中孵育育72小时小时# 6将一大滴沉淀将一大滴沉淀滴在玻片上。滴在玻片上。不要涂开。不要涂开。自然干燥

12、并进行革兰染色。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞如见到大量多形核白细胞则则强烈支持感染强烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution脑脊液（脑脊液（CSF)培养培养主要病原菌：主要病原菌：B群群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2 2月月-2-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌最少最少1ml，最佳，最佳5ml医生通过无菌皮肤医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和菌管中。第二管和第三

13、管用于微生物第三管用于微生物学检测。学检测。# 11500g离心离心15分钟分钟（可能的话）（可能的话）# 2# 3用吸管吸去用吸管吸去上清，留下上清，留下1cc的脑脊液沉淀的脑脊液沉淀注意：不要倾倒注意：不要倾倒# 4滴一滴沉淀滴一滴沉淀于巧克力平皿和于巧克力平皿和血平皿血平皿上下吸取上下吸取10次以上次以上混匀沉淀混匀沉淀# 5CO2中孵中孵育育72小时小时# 6将一大滴沉淀将一大滴沉淀滴在玻片上。滴在玻片上。不要涂开。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞如见到大量多形核白细胞则则强烈支持感染强烈支持感染# 7 Ellen Jo Baron 20

14、07; Use with proper attribution#1#2接种血平皿，麦康凯平皿，接种血平皿，麦康凯平皿，Hektoen或或DCA，若怀疑弧菌则还接种，若怀疑弧菌则还接种TCBS平皿。平皿。37 C 空气孵育空气孵育48h#3粪便标本采集后粪便标本采集后30分钟内进行接种或分钟内进行接种或置于置于cary-blair运输运输培养基中培养基中#4粪便培养粪便培养重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在难辨梭菌（在常规的实验室可能检测不出）常规的实验室可

15、能检测不出）选择血性或脓性的部选择血性或脓性的部分进行接种分进行接种血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性杆菌需进一步鉴定杆菌需进一步鉴定将菌落接种将菌落接种TCBS或含或含0-6盐浓盐浓度的肉汤中。度的肉汤中。麦康凯、麦康凯、HEK或或DCA平皿上不利用平皿上不利用乳糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。乳糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。氧化酶阳性、湿润氧化酶阳性、湿润的米色菌落的米色菌落革兰染色显示弯曲或螺旋形革兰染色显示弯曲或螺旋形的杆菌的杆菌弯曲杆菌属弯曲杆菌属Campy琼脂琼脂#6 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attributio

16、n#5将菌落接种至将菌落接种至Campy琼脂琼脂或使用滤纸法。微需氧环或使用滤纸法。微需氧环境下境下37-42 C 孵育孵育 72 hCO2孵育孵育72h TM培养基上寻找淋球菌，血培养基上寻找淋球菌，血平皿上寻找酵母菌平皿上寻找酵母菌# 2血平皿血平皿& Thayer-Martin平皿平皿# 1# 1接种接种Thayer-Martin培养基培养基&革兰染色革兰染色将拭子在玻片上滚将拭子在玻片上滚动制成一个细胞厚动制成一个细胞厚度的涂片；寻找度的涂片；寻找“线索细胞线索细胞”C. 怀孕怀孕35-37周的孕妇阴道周的孕妇阴道或肛拭子或肛拭子营养肉汤中营养肉汤中孵育过夜孵育过夜血平

17、皿上次代培养检测血平皿上次代培养检测B群链球菌群链球菌# 1# 2CO2中孵育中孵育48小时小时D. 女性的阴道拭子女性的阴道拭子# 1血平皿上寻找血平皿上寻找酵母菌，酵母菌，T-M培养基上寻培养基上寻找淋球菌找淋球菌革兰染色辅助诊断细菌革兰染色辅助诊断细菌性阴道病性阴道病# 1# 230 min内将拭子置于内将拭子置于0.5ml生生理盐水中检测滴虫理盐水中检测滴虫T-M培养基上的淋球菌培养基上的淋球菌血平皿上的酵母菌血平皿上的酵母菌A. 女性的子宫颈或肛拭子女性的子宫颈或肛拭子B. 男性的尿道拭子男性的尿道拭子非病原菌非病原菌金黄色葡萄球菌任何革兰阴性杆菌，包括大肠杆菌和变形杆菌B群群溶血链

18、球菌（溶血链球菌（GBS)，仅为孕妇报告仅为孕妇报告生殖道标本培养生殖道标本培养主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群群溶血链球菌溶血链球菌 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution阴道感染的病因学阴道感染的病因学From a major U.S. Ob/Gyn department.衣原体衣原体混合性混合性传播疾传播疾病病念珠菌念珠菌女女性性百百分分比比细菌性阴细菌性阴道炎道炎正常正常女性生殖道感染的症状和致病菌女性生

19、殖道感染的症状和致病菌子宫颈炎子宫颈炎阴道炎阴道炎其他其他细菌性阴道炎细菌性阴道炎念珠菌念珠菌阴道毛滴虫阴道毛滴虫衣原体衣原体淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌支原体支原体/脲原脲原体体损伤损伤:l单纯疱疹单纯疱疹l人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒l梅毒螺旋体梅毒螺旋体l触染性软疣触染性软疣 痰标本痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌病人需用水清洁口腔，病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，深咳

20、肺部痰，不要唾液不要唾液#1 进行革兰染色以评价标本是否适于接进行革兰染色以评价标本是否适于接种。种。 向临床医生尽快报告重要的革兰染色向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果结果#2#3好：很少扁平好：很少扁平上皮细胞上皮细胞奥普托欣纸片奥普托欣纸片CO2中孵育中孵育48小时小时#4接种巧克力平皿，血接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿平皿和麦康凯平皿#5拒绝：大量拒绝：大量 扁平扁平上皮细胞上皮细胞肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌对重要病原菌进行对重要病原菌进行鉴定鉴定&药敏试验药敏试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌肺炎链球菌肺炎链球菌胆汁溶菌胆汁溶菌 Ellen Jo Baron 2007; U

21、se with proper attribution奥普托欣奥普托欣流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌脓，吸取物或组织标本脓，吸取物或组织标本主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆菌。菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌用酒精消毒伤口用酒精消毒伤口 周围皮肤周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子最差的标本是拭子#1接种血平皿和麦康凯平皿接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或

22、组织，进行如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知革兰染色，将重要结果通知临床医生临床医生#2#3铜绿假单铜绿假单胞菌胞菌中孵育中孵育48小小时时#4对对1或或2种种重要病原菌进行鉴定重要病原菌进行鉴定&药药敏试验敏试验金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌为主菌为主溶血链球菌溶血链球菌肺炎克肺炎克雷伯菌雷伯菌混合的混合的2种肠道革兰阴性种肠道革兰阴性杆菌：杆菌：2种均报告；种均报告；当检出当检出3种或更多病原菌时，报告种或更多病原菌时，报告“混合菌丛混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。道革兰阴性杆菌等。 Elle

23、n Jo Baron 2007; Use with proper attribution#5咽部标本培养咽部标本培养 主要病原菌：主要病原菌：A群群溶血链球菌。溶血链球菌。 选择性报告：溶血隐秘杆菌选择性报告：溶血隐秘杆菌拭子擦取咽部和拭子擦取咽部和扁桃体。不要碰扁桃体。不要碰触舌头和面颊。触舌头和面颊。将拭子擦拭血平皿（羊血将拭子擦拭血平皿（羊血或马血）的或马血）的1/5区域区域在第一区贴相邻的两纸片：复在第一区贴相邻的两纸片：复方磺胺和杆菌肽方磺胺和杆菌肽# 1拭子拭子# 2在烛缸中在烛缸中37C孵育过夜并检查孵育过夜并检查平板；若阴性，继续孵育平板；若阴性，继续孵育过夜过夜总孵育时间总孵

24、育时间48小时小时# 5# 3分区画线分区画线3或或4区区接种环接种环溶血菌落，溶血菌落， 0.5 mm, 对复方磺对复方磺胺耐药，对杆菌肽敏感胺耐药，对杆菌肽敏感A群链球群链球菌（触酶阴性）菌（触酶阴性）# 6杆菌肽杆菌肽& SXT 纸片纸片# 4杆菌肽杆菌肽复方复方磺胺磺胺PYR阳性可确证阳性可确证A群链球菌群链球菌# 7 Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution不要报告不要报告咽炎中非致病菌：咽炎中非致病菌：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌肺炎链球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌卡他莫拉菌卡他莫拉菌 溶血链球菌溶血链球菌 所

25、有革兰阴性杆菌所有革兰阴性杆菌 所有酵母菌所有酵母菌报告结果：报告结果： 1+ to 4+ A群群溶血链球菌溶血链球菌 或1+ to 4+ 非非A群群溶血链球菌溶血链球菌 或未检出未检出溶血链球菌溶血链球菌 # 8# 9#1#2常规：接种沙氏平皿和常规：接种沙氏平皿和Mycobiotic培养基。培养基。 30 C 空气孵育四周。空气孵育四周。对于皮肤癣菌：接种对于皮肤癣菌：接种Mycobiotic和和DTM培养基培养基组织，皮肤刮取物或指甲：将组织，皮肤刮取物或指甲：将一小块完整的标本插入琼脂表一小块完整的标本插入琼脂表面面#3重要的真菌：组重要的真菌：组织活检，痰，脑织活检，痰，脑脊液，血培

26、养脊液，血培养皮肤癣菌：皮肤皮肤癣菌：皮肤刮片，指甲刮片刮片，指甲刮片，根部的头发，根部的头发不要研磨组织：不要研磨组织：使用解剖刀将其使用解剖刀将其切成小块切成小块#4真菌培养真菌培养 重要病原菌：新型隐球菌，人芽囊原虫重要病原菌：新型隐球菌，人芽囊原虫 ，皮肤癣菌，和，皮肤癣菌，和 其他真菌（考虑标本来源和病人情况）其他真菌（考虑标本来源和病人情况）拭子仅用于酵母菌的分离拭子仅用于酵母菌的分离接种血平皿和沙氏平皿接种血平皿和沙氏平皿 Ellen Jo Baron 2008; Use with proper attribution#6将标本研于一滴将标本研于一滴10%KOH，加盖玻片后，加盖

27、玻片后镜检真菌镜检真菌接种后接种后7天内每日观察平皿天内每日观察平皿，之后每周两次，之后每周两次光滑菌落酵母菌光滑菌落酵母菌毛状菌落丝状真菌毛状菌落丝状真菌用通气胶带粘贴平皿的侧面用通气胶带粘贴平皿的侧面或两边或两边#5#1babUrine Culture尿培养尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌#2接种血平皿和麦康凯平皿#3空气孵育空气孵育24小时小时收集中段尿收集中段尿a#4菌落计数菌落计数0.001ml接种环接种环

28、尿尿培培养养的的评评估估标标准准 病病人人 标标本本类类型型 有有意意义义的的病病原原菌菌 C CF FU U/ /m ml l 无无症症状状 清清洁洁留留取取或或留留置置管管留留取取 1 10 00 0, ,0 00 00 0 有有症症状状但但不不需需卧卧床床 清清洁洁留留取取 1 1- -2 2 种种病病原原菌菌。 2 2 种种视视为为污污染染 有有症症状状，性性生生活活活活跃跃的的女女性性 清清洁洁留留取取 1 10 00 0 纯纯培培养养的的肠肠杆杆菌菌科科菌菌 男男性性 清清洁洁留留取取 1 10 00 00 0 潜潜在在病病原原菌菌 所所有有 从从导导尿尿管管中中直直接接留留取取

29、1 10 00 0 个个所所有有种种类类的的潜潜在在病病原原菌菌 所所有有 外外科科或或膀膀胱胱吸吸取取 任任何何数数量量（肉肉汤汤增增菌菌，厌厌氧氧菌菌） 所所有有 有有争争议议 任任何何酵酵母母菌菌 若若 2 种菌生长，对种菌生长，对每种菌进行鉴定和药每种菌进行鉴定和药敏试验；敏试验；若若2种菌生长，报种菌生长，报告告“混合菌群混合菌群”#5注意注意: 革兰阴性杆菌在血平革兰阴性杆菌在血平皿和麦皿和麦 康凯平皿上均康凯平皿上均生长良好生长良好革兰阳性球菌仅在血革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好平皿上生长良好GNR#675,000 cfu/ml50,000 cfu/ml100,000 cfu/ml Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attributionGPC尿道感染尿道感染每年每年850万例尿路感染万例尿路感染, 90%为女为女性性1/2.5个妇女在一生中会得个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流下行性感染：血流肾脏肾脏膀胱（金膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌黄色葡