选修3基因工程

1、回忆：回忆：（1 1）生物的主要遗传物质是什么？）生物的主要遗传物质是什么？（2 2）DNADNA的空间结构和基本组成单位是什么？的空间结构和基本组成单位是什么？（3 3）你还能画出四种脱氧核苷酸的结构简）你还能画出四种脱氧核苷酸的结构简式吗？式吗？（4 4）一条链上的脱氧核苷酸相互连接是通）一条链上的脱氧核苷酸相互连接是通过什么来完成的？过什么来完成的？（5 5）基因控制蛋白质的合成过程。）基因控制蛋白质的合成过程。（6 6）中心法则的图解。）中心法则的图解。定向基因改造设想定向基因改造设想 选修选修3 3 现代生物科技专题现代生物科技专题 基因工程基因工程钦州二中高中生物备课组段敏钦州二中

2、高中生物备课组段敏 一、基因工程的基本内容：一、基因工程的基本内容： 基因工程的概念：基因工程的概念：基因重组基因重组 操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因（基因（DNADNA）操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结结 果果优点优点打破生殖隔离定向改造生物打破生殖隔离定向改造生物时间短时间短人类需要的基因产物人类需要的基因产物基因工程的理论基础：基因工程的理论基础：水母水母培育转基因荧光斑马鱼的过程是怎样的呢？培育转基因荧光斑马鱼的过程是怎样的呢？普通斑马鱼普通斑马鱼荧光斑马鱼荧光斑马鱼“分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针

3、分子缝合针”“分子运输车分子运输车”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶基因进入受体细基因进入受体细胞的载体胞的载体二、基因工程的基本操作工具：二、基因工程的基本操作工具：（1 1）分布：）分布：主要在微生物中。主要在微生物中。 （2 2）限制性内切酶的特性：）限制性内切酶的特性：一种限制性内切一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点切割能在特定的切点切割DNADNA分子。分子。（3 3）举例：）举例：大肠杆菌的一种限制酶（大肠杆菌的一种限制酶（EcoREcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，并

4、在序列，并在G G和和A A之间切开；之间切开；SmaSma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，并在序列，并在C C和和G G之间切割。之间切割。、基因的手术刀、基因的手术刀限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶( (限制酶限制酶）CGAATTATAGTC磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键EcoREcoR作用的部位：作用的部位：磷酸二酯键磷酸二酯键 思考：结果产生几个切口？产生几个末端？思考：结果产生几个切口？产生几个末端？会产生黏性末端或平末端会产生黏性末端或平末端作用的结果：作用的结果：错位切错位切平切平切拓展补充：拓展补充：获取一个目的基因需限制酶剪切获取一个目的基因需限制酶剪切

5、次，共次，共产生产生 个黏性末端或平末端。个黏性末端或平末端。 两两4 4练习使用练习使用EcoRI EcoRI 剪切目的基因剪切目的基因CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG 目的基因目的基因黏性末端黏性末端主要来源主要来源种类种类 特点特点结果结果主要从原核生物中分离主要从原核生物中分离（约（约40004000种）种）专一性专一性 切割切割磷酸二酯键磷酸二酯键，一个切口，一个切口产生两个黏性末端或

6、产生两个黏性末端或两个两个平末端。平末端。 EcoEcoR R 黏性末端黏性末端（识别（识别GAATTCGAATTC序列序列）SmaSma 平末端平末端（识别（识别CCCGGGCCCGGG序列序列）错位切错位切平切平切（举例）（举例）小结：小结：、基因的缝合针、基因的缝合针DNADNA连接酶连接酶类型类型作用作用结果结果作用作用部位部位形成单链形成单链DNADNA分子分子碱基对间碱基对间的氢键的氢键 DNADNA分子分子 形成新的形成新的DNADNA分子分子（形成）（形成）磷酸二酯键磷酸二酯键游离脱氧游离脱氧核苷酸核苷酸形成重组形成重组DNADNA分子分子（形成）（形成）磷酸二酯键磷酸二酯键D

7、NADNA分子片段分子片段形成黏性末形成黏性末端或平末端端或平末端（断开）（断开）磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA分子分子作用作用底物底物解旋酶解旋酶 DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶限制酶限制酶比较比较项目项目几种酶的比较：几种酶的比较：3 3、基因的运输车、基因的运输车载体载体将外源基因送入受体细胞将外源基因送入受体细胞作用：作用：具备的条件：具备的条件： u 能在宿主细胞内复制并稳定能在宿主细胞内复制并稳定地保存地保存u 具有多个限制酶切点具有多个限制酶切点u 具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进，便于进行筛选行筛选种类：种类： 质粒质粒、动植物病毒、动植物病毒、噬菌

8、体衍生物噬菌体衍生物质粒：质粒：细菌细菌或或酵母菌酵母菌等生等生物细胞中，是拟核或细胞物细胞中，是拟核或细胞核外能够自主复制的很小核外能够自主复制的很小的的环状环状DNADNA分子分子质粒质粒 -最常用的载体最常用的载体最常用的质粒是大肠杆菌的质粒最常用的质粒是大肠杆菌的质粒判断：判断：质粒只存在于原核细胞中？质粒只存在于原核细胞中？小结小结限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶载体载体来源来源特点特点结果结果作用作用种类种类特点特点种类种类特点特点条件条件DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的、基因表达载体的构建构建3 3、

9、将目的基因导入、将目的基因导入受体细胞受体细胞4 4、目的基因的检测、目的基因的检测与鉴定与鉴定三、基因操作的基三、基因操作的基本操作程序本操作程序 举例：举例：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是具有一些调控作用的因子。的基因等，也可以是具有一些调控作用的因子。目的基因：目的基因：主要是指编码特定蛋白质的结构基因。主要是指编码特定蛋白质的结构基因。补充：基因的结构补充：基因

10、的结构1.1.原核细胞的基因结构：原核细胞的基因结构：2.2.真核细胞的基因结构：真核细胞的基因结构：1.1. 直接从自然界中已有的物种中分离出来直接从自然界中已有的物种中分离出来供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪去用限制酶剪去多余部分多余部分目的基因目的基因限制酶限制酶目前被较广泛目前被较广泛提取使用的目的基提取使用的目的基因有：苏云金杆菌因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病白基因、植物抗病基因等。基因等。2 2、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因用适当用适当限制酶

11、切割限制酶切割与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群提取某生物提取某生物全部全部DNADNA许许 多多DNADNA片段片段该生物基该生物基因组文库因组文库例如：例如：cDNAcDNA文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成与载体连与载体连接导入受接导入受体菌群体菌群该生物该生物cDNAcDNA文库文库DNADNA双链复制双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列原理：原理：前提：前提：PCRPCR：多聚酶链式反应：多聚酶链式反应3 3、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR扩增仪扩增仪1.1.四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸2

12、.DNA2.DNA的两条模板链的两条模板链3.3.热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶）酶）4.4.一对引物一对引物条件：条件：过程：过程： 1.1.目的基因目的基因DNADNA受热受热(90-95)(90-95)变性后解链变性后解链成单链；成单链；2.2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.3.合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。4.4.人工合成法人工合成法化学合成法：化学合成法：适用范围：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。DNADNA合成仪合成：合成仪合成：利用合成仪按照人们

13、预先设利用合成仪按照人们预先设定的定的DNADNA序列序列, ,从无到有从无到有, ,从头合成从头合成 反转录法：（反转录法：（cDNAcDNA文库）文库）小结：目的基因的获取小结：目的基因的获取1.1.获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增人工合成人工合成PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶

14、高温下变性解旋高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR(PCR扩扩增仪内增仪内) )主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通的普通的DNADNA聚合酶等聚合酶等人工合成法：人工合成法：化学合成法化学合成法 ：适用范围：适用范围：已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。DNADNA合成仪合成：合成仪合成：利用合成仪按照人们预先设利用合成仪按照人们预先设定的定的DNADNA序列序列, ,从无到有从无到有, ,

15、从头合成从头合成 反转录法：（反转录法：（cDNAcDNA文库）文库）使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并，并且可以且可以遗传遗传给下一代给下一代使目的基因能够使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用1 1、基因、基因表达载体表达载体构建的目的构建的目的？（？（P11P11）思考：一定数量的目的基因与载体混合后，加入思考：一定数量的目的基因与载体混合后，加入DNADNA连接酶，两两连接的重组连接酶，两两连接的重组DNADNA有几种？有几种？（含有目的基因）（含有目的基因）（载体）（载体）环状环状启动子：启动子：一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段，位于

16、基因片段，位于基因的首端，是的首端，是RNARNA聚合酶识别和结合的部位。聚合酶识别和结合的部位。终止子：终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的构的DNADNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因：标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因目的基因目的基因启动子启动子终终止子止子标记基因标记基因

17、启动子启动子(DNA(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(RNA);(RNA);终止子终止子(DNA(DNA片段片段)终止密码子终止密码子(RNA)(RNA)。思考思考1 1：常用的受体细胞有哪些？：常用的受体细胞有哪些？动物、植物、微生物。动物、植物、微生物。思考思考2 2：什么叫转化？：什么叫转化？目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持体细胞内维持稳定和表达稳定和表达的过程。的过程。（1 1）农杆菌转化法：）农杆菌转化法：常用于常用于双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物1 1、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞两次拼接？两次导入？两次

18、拼接？两次导入？组织培养技术组织培养技术优点：优点：经济有效经济有效（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法（2 2）基因枪法）基因枪法缺点：缺点：成本较高成本较高 受体细胞受体细胞 ( (单子叶植物单子叶植物) )我国科学家独创，转基因抗虫棉我国科学家独创，转基因抗虫棉方法：方法：显微注射技术（最常用，最有效）显微注射技术（最常用，最有效）受体细胞：受体细胞：常用受精卵常用受精卵过程：过程：目的基因的表达载体提纯目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物2 2、将目的基因导入动物细胞：、将目的基因导入动物细胞：3、将目的基因导入微生

19、物细胞、将目的基因导入微生物细胞2.2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：3.3.转化方法：转化方法：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少1.1.常用菌：常用菌： 大肠杆菌等。大肠杆菌等。CaCa2+2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子用用CaCa2 2处理，处理，增加细菌细增加细菌细胞壁的通透胞壁的通透性性思考：为什么思考：为什么要用要用CaCa2+2+处理处理受体细胞？受体细胞？受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细

20、胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/ /个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞小结：小结：1 1、导入检测、导入检测（1 1）目的：）目的：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是上是否插入了目的基因否插入了目的基因（2 2）方法：）方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术(4)(4)基因探针基因探针: : 含含目的基因的目的基因的DNADNA片段片段用放射性同位素、荧用放射性同位素、荧光等作标记光等作标记, ,以此做探针。以此

21、做探针。GTACAGCGTA基因探针基因探针GACATAGCTACA转基因生物的转基因生物的DNA DNA CTGTATCGATGTGTACAGCGTA基因探针基因探针杂交判断过程：使探针和转基因生物的基因组杂交杂交判断过程：使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显若显示出示出杂交带杂交带, ,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNADNA中中CGTCATGTCGCATGCT转基因生物的转基因生物的DNA DNA GCAGTACAGCGTACGAGTACAGCGTA基因探针基因探针2 2、转录检测、转录检测（1 1）目的：）目的：检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了m

22、RNAmRNA（2 2）方法：）方法：分子杂交技术分子杂交技术（3 3）杂交的对象：）杂交的对象： 从转基因生物中提取的从转基因生物中提取的mRNA.mRNA.3 3、翻译检测、翻译检测（1 1）目的：）目的：检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质（2 2）方法：）方法：抗原抗体杂交技术抗原抗体杂交技术从转基因生物中提取的蛋白质从转基因生物中提取的蛋白质抗原：抗原：抗体：抗体：将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体行免疫产生的相应抗体4.4. 个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较等抗虫、抗病接种实验，活性比较等分子水平分子水平检测检测个体水平鉴定：个体水平鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入插入了目的基因了目的基因检测目的基因是否检测目的基因是否转录转录出出了了mRNAmRNA检测目的基因是否检测目的基因是否翻译翻译成成蛋白质蛋白质DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交如：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等如：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测鉴定重组性状的表达检测鉴定重组性状的表达小结：小结：人体细胞人体细胞质粒质粒大肠杆菌大肠杆菌目的基因目的基因(人胰岛素基因人胰岛素基因)用