生物药物分析与检测：第六章 生物检定法

1、标题 第六章 生物检定法生物检定：利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。整体和离体测定in vivo: 直接反映药品对生物的综合作用，但需要动物，供试品量多，耗时长；In vitro: 不一定能反映供试品在整体的作用，但个体差异小，实验时间短，精密度和灵敏度高，能在一定程度上保留药理作用特性。生物检定的应用范围1、药物的效价测定；2、体内微量生理活性物质的测定；3、中药质量的控制；4、某些有害杂质的限度检查。第一节 胰岛素生物检定法胰岛素是治疗糖尿病的特效药，其特有优势:1、控制血糖能力最强；2、毒副作用小，胰岛素为正常激素，无任何毒性，不损伤

2、肝肾。 但因为口服生物利用度低，临床上常用其针剂。这给患者带来了诸多不便，此外长期注射还会产生许多不良反应。但目前有关胰岛素非注射给药普遍存在的问题是(1):膜障，胰岛素分子易聚集；（2）：酶解，被胃肠道中的蛋白水解酶降解。 许多蛋白质，如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体内常以无活性的前体存在，在一定情况下经体内的蛋白酶水解，切去部分肽段后，才变成有活性的蛋白质。 前体胰岛素（84 aa） A链（21aa） B链（30aa） C链（33aa） 活性胰岛素胰岛素的结构B链A链A、B链胰岛素不稳定难吸收研究背景胰岛素胰岛素六聚体研究背景长期以来，胰岛素的效价采用生物测定法，不过，2010年版药典中，胰

3、岛素的含量采用HPLC法，生物测定法则用于胰岛素的生物活性检测效价（potency)测定是生物检定的主要内容，它以药理为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，利用生物体在一定条件下比较供试品与标准品或对照品所产生的特定反应（可测量、量化的生理指标或生物药效或毒力）的一种定量方法，因而被称为定量毒理学。检定方法取健康无伤、同一来源、同一性别、出生日期相近的成年小鼠，体重相差不得超过3g，按体重随机分成4组，每组不少于10只,逐只编号, 各组小鼠分别自皮下注入一种浓度的标准品或供试品稀释液，每鼠0.20.3ml，但各鼠的注射体积（ml）应相等。注射后40分钟，按给药顺序分别自眼静脉丛采血，用适

4、宜的方法，如葡萄糖氧化酶过氧化酶法测定血糖值。第一次给药后间隔至少3小时,按双交叉设计，对每组的各鼠进行第二次给药，并测定给药后40分钟的血糖值。照生物检定统计法(附录)中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差。2010年版的药典已经简化了程序。1、实验动物减半；2、取消双交叉实验。注意：1、实验常用剂量：低剂量组使血糖降低20%-30%，高剂量组血糖值不能低于2.8。2、动物质量的选择。3、环境的因素。第二节 肝素生物检定法药理作用：(1)抗凝作用，体内、体外均有效；机制：加速抗凝血酶(AT)对多种凝血因子（、等含丝氨酸残基的蛋白酶）的灭活。(2)其它：降脂作用；抗炎作用；抑制血管平

5、滑肌增生等。肝素体内过程：口服不吸收，常静脉滴注给药。临床应用：(1)血栓栓塞性疾病：防止血栓形成；(2)心血管手术、心导管、血液透析血液标本等抗凝。不良反应：(1)自发性出血；(2)过敏反应；(3)孕妇使用易致早产。低分子量肝素low-moleucular-weight heparins,LMWHs抗凝作用及应用与肝素相似。血小板减少较少。安全，一般不必监测抗凝活性。维持时间长，每日一次。促t-PA释放，有助血栓溶解。制剂：依诺肝素enoxaparin 替他肝素tedelparin肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视. 也是我国主要的出口药物之一。人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和

6、调节血脂的作用, 还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。肝素钠效价测定采用羊血浆法 . 即将肝素钠标准品和供试品加入柠檬酸羊血浆中, 钙化一定时间后观察两者的凝固程度, 如标准品和供试品配成相同的浓度又得到相同的凝固程度, 则说明两者效价相同, 以此来对比测定未知样品的效价.取管径均匀、洁净干燥的小试管20 支, 分别加入血浆0. 5 mL, 置( 375) 恒温水浴中预热5 min10 min后, 依次每管加入一种浓度( 质量百分浓度) 的标准品或供试品稀释液( 1 % 、0. 5 %、0. 2 %) 及氯化钙溶液( 每种浓度3 管, 各浓度的试管支数相等) , 加入氯化钙溶液后, 立即混

7、匀, 并开始计算时间, 注意观察并计算各管凝结时间. 将各管凝结时间换成对数参照生物检定统计法( 中国药典附录XIV) 中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差.第三节 抗生素的微生物检定法抗生素定义是由微生物分泌的化合物，其稀溶液具有抑制或杀灭细菌的能力。家里使用的消毒的东西也能杀灭生命体但只能叫消毒剂，这种消毒剂不能用在人体里面，只能用在体外的环境消毒使用。抗生素是能在人体里面使用的，毒性比较低安全性比较高的药物。抗生素的作用就是杀灭感染我们体内的微生物：病毒、细菌青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。1928年的一天，弗莱明在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌。由于盖子没有盖

8、好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱明据此发明了葡萄球菌的克星青霉素。 图中央是青霉菌，周围是致病细菌。距青霉素最远的细菌个大、色浓，活力十足；距青霉菌较近的细菌个较小、色较浅，活力较差；而最接近青霉菌的细菌个最小、色发白，显然已经死亡 二战中，为了拯救战场上的大批伤员，急需大批青霉素，美国政府甚至不惜动用军用飞机，从世界各地采集含青霉菌的土壤以筛选分泌青霉菌种。青霉素终于

9、在1943年问世，自此，青霉素被广泛应用，创造了一个绿色的医学奇迹，他击败了战时最可怕的杀手伤口感染。1944年，青霉素因治好了英国首相丘吉尔的肺炎而闻名于世。青霉素对人类最显著的贡献是在第二次世界大战规模最大的登陆战诺曼底战役中，它救治了无数迎着德军炮火登陆而负伤的盟军士兵。 如果说，原子弹是第二次世界大战中杀伤力量最强的武器，那么，青霉素就是从这个战场拯救生命最多的药物。难怪有人把原子弹、雷达和青霉素并列为第二次世界大战期间的三大科学发明。为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗洛里于1945年，共同获得诺贝尔医学和生理学奖。 抗生素的危害是什么 抗生素产生很多不良反应，这是大家屡见不

10、鲜的。比如小孩使用了庆大霉素、丁胺卡那霉素出现了耳聋，以后会成为聋哑儿童，成人使用可能会有肾脏的问题。还有红霉素里面的四环素，大量使用会造成肝脏的损害，小孩使用会影响牙齿和骨骼的发育问题。 是药三分毒，抗生素也不例外。研究表明，每种抗生素对人体均有不同程度的伤害。链霉素、卡那霉素可引起眩晕、耳鸣、耳聋；庆大霉素、卡那霉素、万古霉素可损害肾脏；红霉素、林可霉素、强力霉素可引起厌食、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道反应；氯霉素可引起白细胞减少甚至再生障碍性贫血。链霉素、氯霉素、红霉素、先锋霉素会抑制免疫功能，削弱机体抵抗力。抗生素可使病菌产生耐药性！抗生素使用以后微生物可以针对它产生耐药性，是细菌保

11、护自己的措施。如果我们滥用抗生素，环境中存在的这些致病微生物都是耐药的，那人体生病感染的都是耐药菌，很难有有效的药物治疗，最后受到损害的是我们人类自己。据统计，我国每年有8万人直接或间接死于滥用抗生素，因此造成的肌体损伤以及病菌耐药性更是无法估量，滥用抗生素使我们为战胜疾病付出的代价越来越高使用抗生素的错误认识抗菌素越贵越好。不少人认为，抗菌素的价格越贵越好，越及时治病。要知道药不是普通商品，“便宜没好货”的规律不适用于药品。只要使用得当，几分钱一片的药也能达到药到病除的疗效。随意滥用。最典型的例子就是许多人用抗菌素治疗感冒。虽然抗菌素能抗细菌和某些微生物，但不抗病毒，感冒大多是病毒感染，如果

12、随便乱用抗菌素，只会增加其副作用，并使机体产生耐药性。无规律服药。一些人患病后，病情较重时能按时按量服药，一旦病情缓解，服药便随心所欲。抗菌素的药效有赖于其有效的血药浓度，如达不到有效的血药浓度，不但不能彻底杀灭细菌，反而会使细菌产生耐药性。多多益善。有人认为吃抗菌素越多越好，只要是抗菌素就能消炎，甚至把几种抗菌素一起服用。对于确属细菌感染的疾病，只能根据引起疾病的不同菌种选择相应的药物。 （一）概述 效价测定技术方法： 1、物理、化学法：简便、快速，本身纯度不高，采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情况下可采用 2、微生物法：原理和临床应用的要求相一致，直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高

13、，需用量较小，因此被广泛使用。管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用，从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素浓度范围内，对数剂量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成正比。（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈： 将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培养基中的试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度，随离开小钢管的距离增大而降低，离小钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分子愈少，相应的抗生素浓度愈低

14、。当抗生素分子扩散到一定时间，在小钢管周围形成一个能有效的抑制试验菌生长的范围，也就是通常所说的抑菌圈。 2、影响抑菌圈大小的因素： 抑菌圈的半径(大小)与最小抑菌浓度C，琼脂层厚度H，抗生素在琼脂内扩散系数D，抗生素在小钢管中的量M，以及抗生素的扩散时间T有关：这些因素的改变，常会影响抑菌圈的大小和清晰度。 按设计原理不同分:管碟法一剂量法（标准曲线法）二剂量法（22法）三剂量法（33法） 日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。3、管碟法常用的三种方法：抗生素的效价和单位 抗生素的含量用效价和单位表示。该词有时不加区别统称为效价单位。 效价（otency）：

15、指检品的实际单位数与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。 单位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分的具体尺度。抗生素效价检定管碟法操作流程:标准品的称量 标准品的稀释标准品溶液 供试品的称量 供试品的稀释供试品溶液 缓冲液的制备 培养基的制备 底层20 ml菌层5ml 平板的制备 凝固后 凝固后 菌液的制备 加菌液 加小钢管-可靠性测验，计算结果 测量抑菌圈培 养 加陶瓦园盖二剂量法 二剂量法的原理与测定方法： 该法系将抗生素的标准及检品各稀释成一定比例(2:1或4:1)的二种剂量，即高剂量和低剂量。在同一培养基平皿上进行对比，根据它们所产生的抑菌圈

16、大小计算检品的效价。 二、操作方法基本要点： 高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径在2024 mm，个别抗生素的抑菌圈可在1824 mm； 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可较小； 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量之比为4:1的比率。 操作步骤： 1. 称量 2. 稀释 3. 双碟的制备 4. 放置钢管 5. 滴加抗生素溶液 6. 抑菌圈测量图46：钢管放置器（北京先驱威锋技术开发公司生产开发） 返回抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定。容易产生降解杂志，故各国药典均以为生物鉴定法为主要含量测定法。标准品的称

17、量标准品返回 试验用菌液、缓冲液、培养基、 标准品与供试品溶液的制备 制备过程返回双碟的制备 制备底层制备菌层放置小钢管返回 滴加药液到小钢管内 返回 在恒温培养箱中培养至规定时间 （盖上陶瓷盖）返回测量抑菌圈测量过程（活动）方法一测量仪器方法二测量过程（活动）返回计算结果返回影响效价测定的因素实验菌种培养基双碟的制备培养温度和时间抗生素污染标准品直线的斜率和截距二、浊度法浊度法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品对试验菌生长抑制的程度，测定供试品效价的一种方法。第四节 生化药物的效力捡定动物保护力试验定义：将制品对动物进行自动（或被动）免疫后，用活