第二章电生理研究方法2012.9.18.

1、 电生理学技术的发展 1825年 电流计发明与应用1922年 电子管放大器和阴极射线示波器问世20世纪40年代 微电极技术产生 动作电位的钠学说20世纪50年代 电压钳技术产生20世纪70年代 膜片钳技术 谢灵顿谢灵顿 ( Sherrington) （1857-1952） 英国神经生物学家。英国神经生物学家。 发现中枢神经反射活动规律发现中枢神经反射活动规律 艾德里安艾德里安 (Adrian ) （1889-1977） 英国生理学家。英国生理学家。 阐明动作电位及其传导规律阐明动作电位及其传导规律1932年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖厄兰格厄兰格 (Erlanger)（1874-1965） （美）（

2、美）两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能加塞加塞 (Gasser )（1888-1963） （美）（美）1944年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖Hermann Hermann 变质学说变质学说(Alteration theory)(Alteration theory)。 18791879年年，他指出，在损伤的神经或肌肉中所出现，他指出，在损伤的神经或肌肉中所出现的负电位差，是发生于损伤一端的，后来进一步证明的负电位差，是发生于损伤一端的，后来进一步证明了了完全死亡的组织上是不产生这种负电位差完全死亡的组织上是不产生这种负电位差的。这种的。这种

3、正常部位与损伤部位之间的电位差，称为正常部位与损伤部位之间的电位差，称为损伤电位损伤电位 (injury potential) (injury potential) 这种电流则相应地称为这种电流则相应地称为损伤电损伤电流流（injury currentinjury current）HermannHermann认为，这种电流是损认为，这种电流是损伤时才产生的。因此伤时才产生的。因此当组织损伤时，在生理和化学作当组织损伤时，在生理和化学作用的影响下产生了局部的变质，因此与正常部位之间用的影响下产生了局部的变质，因此与正常部位之间产生了电位差。产生了电位差。BernsteinBernstein膜学说

4、膜学说19021902年，年，BernsteinBernstein提出生物电发生的提出生物电发生的膜学说膜学说：“神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性，而神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，因此由于细胞对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧就形成一个电位差，内外钾离子分布不均匀，在膜两侧就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到来时，膜变为无选择通透的此即静息电位，神经冲动到来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失，动作电位因而产生。膜，静息电位消失，动作电位因而产生。” HodgkinHodgkin和

5、和HuxleyHuxley离子学说（动作电位的钠学说）离子学说（动作电位的钠学说） 19401940年前后，由于年前后，由于HodgkinHodgkin和和HuxleyHuxley在枪乌贼巨在枪乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电位的事实，轴突上发现动作电位大于静息电位的事实，膜两膜两侧溶液成分不同；膜对离子具有选择性通透性，侧溶液成分不同；膜对离子具有选择性通透性，这种通透性在动作电位时发生改变。静息时，对这种通透性在动作电位时发生改变。静息时，对K+K+通透，兴奋对通透，兴奋对 Na+ Na+ 通透超过通透超过 K+K+，通透性变化，通透性变化说明了神经的电兴奋，说明了神经的电兴奋，产生了产

6、生了离子学说（钠学离子学说（钠学说）说）。Ecclesu19761976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所NeherNeher和和SakmannSakmann首次首次 在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, AChAcetylcholine, ACh）激活的单通道离子电流，从而产生了）激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（膜片钳技术（patch clamp techniquepatch clamp technique）；）；u19801980年年SigworthSig

7、worth等获得等获得10-100G10-100G的高阻封接（的高阻封接（GigasealGigaseal），），19811981年年HamillHamill和和NeherNeher等对该技术进行了改进，引进了全细胞等对该技术进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善；记录技术，从而使该技术更趋完善；u19831983年年1010月，月，Single-Channel RecordingSingle-Channel Recording一书的问世，一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。奠定了膜片钳技术的里程碑。 Neher Sakmann （1944-） （1942-） （德国细胞生理

8、学家）（德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获二人共获1991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。内尔在实验室进行膜片箝研究工作内尔在实验室进行膜片箝研究工作 1983年年10月第一版月第一版

9、Single-Channel Recording封面封面电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到2002年）年）获获奖奖时时间间获获奖奖者者国国别别获获奖奖工工作作获获奖奖题题目目或或著著作作1 19 92 24 4埃埃因因托托芬芬 ( (E Ei in nt th ho ov ve en n) )( (1 18 86 60 0- -1 19 92 27 7) )荷荷兰兰研研制制成成功功记记录录心心脏脏动动作作电电位位的的心心电电图图机机并并命命名名心心电电图图波波。“弦弦线线式式电电流流计计和和心心脏脏动动作作电电位位的的测测量量”1 19 93 32 2艾艾德德里里

10、安安 ( (A Ad dr ri ia an n) )( (1 18 88 89 9- -1 19 97 77 7) )谢谢灵灵顿顿 ( (S Sh he er rr ri in ng gt to on n) )( (1 18 85 57 7- -1 19 95 52 2) )英英国国英英国国发发现现神神经经元元的的功功能能“神神经经纤纤维维的的活活动动”神神经经系系统统的的整整合合作作用用1 19 94 44 4加加塞塞 ( (G Ga as ss se er r) )( (1 18 88 88 8- -1 19 96 63 3) )厄厄兰兰格格 ( (E Er rl la an ng ge

11、 er r) )( (1 18 87 74 4- -1 19 96 65 5) )美美国国美美国国两两人人合合作作发发明明了了示示波波器器，并并研研究究神神经经纤纤维维的的功功能能神神经经活活动动的的电电表表现现1 19 96 63 3埃埃克克尔尔斯斯 ( (E Ec cc cl le es s ) )（1 19 90 03 3- -1 19 99 97 7）霍霍奇奇金金 ( (H Ho od dg gk ki in n) )（1 19 91 14 4- -1 19 99 98 8）赫赫克克斯斯利利 ( (H Hu ux xl le ey y) )（1 19 91 17 7- -）澳澳大大利利

12、亚亚英英国国英英国国用用 1 1 微微米米尖尖端端的的微微电电极极研研究究中中枢枢兴兴奋奋和和抑抑制制两两人人合合作作揭揭示示了了神神经经元元通通过过电电脉脉冲冲与与其其它它神神经经元元传传递递信信息息“突突触触后后抑抑制制的的离离子子机机制制”“神神经经传传导导的的离离子子基基础础”“神神经经兴兴奋奋和和传传导导的的定定量量分分析析”1 19 96 67 7哈哈特特兰兰 ( (H Ha ar rt tl li in ne e) )( (1 19 90 02 2- -1 19 98 83 3) )格格兰兰尼尼特特 ( (G Gr ra an ni it t) )( (1 19 90 00 0-

13、 -1 19 99 91 1) )美美瑞瑞典典视视觉觉神神经经生生理理（视视觉觉神神经经元元间间的的抑抑制制）视视觉觉神神经经生生理理（视视网网膜膜电电图图）“受受体体与与感感知知”1 19 97 70 0卡卡茨茨 ( (K Ka at tz z) )( (1 19 91 11 1- - ) )英英国国提提出出神神经经递递质质释释放放的的量量子子学学说说“神神经经末末梢梢的的化化学学传传递递”1 19 98 81 1休休伯伯尔尔 ( (H Hu ub be el l) )( (1 19 92 26 6- -) )威威塞塞尔尔 ( (W Wi ie es se el l) )( (1 19 92

14、 24 4- -) )美美国国瑞瑞典典两两人人合合作作对对视视觉觉皮皮层层的的结结构构和和功功能能进进行行了了重重要要研研究究“视视觉觉皮皮层层的的研研究究”“视视皮皮层层的的发发育育和和环环境境的的影影响响”1 19 99 91 1内内尔尔 ( (N Ne eh he er r) )( (1 19 94 44 4- -) )萨萨克克曼曼 ( (S Sa ak km ma an nn n) )( (1 19 94 42 2- -) )德德国国德德国国发发明明膜膜片片箝箝技技术术，首首次次证证实实细细胞胞膜膜上上存存在在离离子子通通道道单单通通道道记记录录 第一节 常规心肌电生理研究技术 在常规

15、心肌电生理研究中，主要是采用玻璃微电极插入在体或离体心肌细胞内，记录心肌细胞的跨膜电活动，并研究各种因素对其电活动的影响。一、常用电生理仪器v 刺激系统（刺激器等）v 检测系统（电极、换能器）v 放大系统（前置、后置放大器）v 记录显示系统(示波器、记录仪、 计算机）1.电子刺激器（Electronic stimulator） 电刺激不易损伤组织，又能定量而准确地重复使用。方波（矩形波，square wave）的幅度、波宽和频率都可分别进行调节，所以矩形波电子刺激器可作为理想的刺激源。SEN-7203方波刺激脉冲的参数要求：（1） 幅度（强度，amplitude）矩形脉冲电压的最大瞬时值 （2

16、） 波宽（刺激持续时间 time）（3）频率（frequency） 一个脉冲循环所需的时间为周期，周期 的倒数（即1S内所含的周期数目）称为频率（4）延迟（Delay）从触发脉冲到刺激方波的出现，这一段时间称为延迟。（5）刺激方式（Pattern of stimulation） 单刺激、连续刺激、双脉冲刺激（6）同步输出（Synchronized output）同步脉冲表示一次刺激的时间起点（7）刺激隔离器（Isolator） 当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时，刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器记录到一个刺激电流产生的波形，即刺激伪迹。隔

17、离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能，减小伪迹并与电位分开。同时，消除50周交流电感应造成的干扰。2.微电极放大器（microelectrode amplifier） 组成：精密稳压电源、高输入阻抗探头、主放大器、电容补偿电路、校正电路、低通滤波电路等Axopatch 200B （AXON，USA） Fast magnitude , Fast time constant（） 钮钮 Slow magnitude , Slow time constant（）钮）钮 WHOLE-CELL CAP钮钮要求：（1）足够高的放大能力 （2）频率响应范围大 0100Hz（3） 低噪声 50uV（4） 高的

18、辨差比（共模抑制比）1000:1（5） 高输入阻抗 1000M（6）低频与高频滤波低频滤波-用于变化速度快的生物电变化高频滤波-用于减少噪声，提高信噪比3 示波器（oscillograph）要求： 高灵敏度 扫描速度快 频率高类型：双线示波器 多线示波器 长余辉慢扫描示波器 记忆示波器VC-114 贮存和分析电生理实验结果的仪器（1） 示波照相机（2） 磁带记录仪（3） 电子计算机A/D转换- -把生物电（模拟 ）信号转换成数字信号D/A转换- 把数字信号转换成模拟信号二 细胞外记录（Extracellular recording）细胞外记录是把电极安放在心肌表面或附近引导心肌组织或细胞的电活

19、动。适应范围：适应范围：（1）长时间的实验；（2）对清醒的、能自由活动的动物研究；（3）从不同组织部位作同时的多导记录；（4）研究非常小的细胞，数量多而难于 孤立起来，接触和穿刺都易于损伤等；（5）研究器官的总的活动。电极：（1）玻璃微电极（2）金属电极（3）离子选择性电极（4）单极电极（5）多管电极三 在体心脏电活动的细胞内记录 （intracellular recording in situ） 实验装置实验装置 包括浮置式玻璃微电极、微电极推进器、微电极放大器、示波器、照相装置、记录仪、计算机等推进器微放器示波器监听器照相机记录仪计算机打印机微电极微电极心脏心脏 动物手术 电极制作要求 插

20、入 应用范围 生理、药理、心肌缺血等 优点：在近于生理状态下实验，可观察整 体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特性的影响机制 缺点：记录不持久，影响因素多四 离体心肌电活动的细胞内记录（intracellular recording in vitro）1 实验装置2 微电极、标准微电极、微推进器3 浴槽与灌流装置 生理盐溶液、混合气体、摄氏3037度4 刺激器 5 应用范围优点 稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分6 7 观察指标 RP , APA, APD10, APD50, APD90, Vmax第二节：电压钳制

21、技术(Voltage clamp technique) 利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐明跨膜电变化机制，必需应用电压钳制技术。这一技术首先是由Cole及其同事设计，在经Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。 一、细胞膜的生物物理特性(Biophysical properties of cell membrane) 细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质(cable properties)的

22、反映。(轴浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特性从定的等效电路及其时间常数和空间常数得到证实。 (一) 细胞膜的等效电路 从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻，Ri），膜电阻（横向电阻，Rm），膜电容（Cm）和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四方面特性即可构成其等效电路（Equivalent Circuit）。outsideRi inside膜电位等效电路的简化图Cm 膜电容Rm 膜电阻Em 离子平衡电位Ro 细胞外液的纵向电阻（/cm） Ri 轴浆的纵向电阻（

23、/cm）RoCmRmEm+- 细胞膜的等效电路是一个并联的阻容细胞膜的等效电路是一个并联的阻容路，膜活动时既有电压的改变，同时又有路，膜活动时既有电压的改变，同时又有电流的改变。电流的改变。电位的改变可引起电容器的电位的改变可引起电容器的充、放电，也可用于电阻器上的电流流动充、放电，也可用于电阻器上的电流流动。通过电容器的电流为通过电容器的电流为Ic Ic ，通过电阻的电，通过电阻的电流为流为IrIr。1 纵向电阻（Ro、Ri） 由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，它与直径是反比关系（直径大、电阻小，直径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。它是单位长度

24、的电阻，单位是/cm ，细胞外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro）较Ri小。 2.横向电阻（redial resistance） 即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜由双层磷脂构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜的有限能力。 膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小反映了膜结构电学方面的差异。 膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律Em = Im * RmI = V / R（欧姆定律），膜电阻越大，对电流的导通能力越小。膜电阻的倒数膜电导（condactance，gm。R=1/G）。g = I / V 或 I = g V膜电位恒定情况下，电导与电流成正比，膜电悼越大，膜电流也就越大。 不同的离子有不同的膜电导。同一种离子，不同的离子有不同的膜电导。同一种离子，其电导也是可变的。其电导也是可变的。细胞膜环境、生理状态、代谢水平、膜功能细胞膜环境、生理状态、代谢水平、膜功能状态的变动，状态的变动，膜电阻（膜电阻（RmRm）将发生改变。）将发生改变。电导电导的单位是的单位是SiemensSiemens，S S，mho