仪器分析讲稿(第3章液相)

1、Instrumental Analytical 仪器仪器 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High Performance Liquid High Performance Liquid Chromatography,HPLCChromatography,HPLC第第 3 3 章章内容提要内容提要1 1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点2 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素3 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法的主要类型及其分离原理4 4 液相色谱法的固定相液相色谱法的固定相5 5 液相色谱法流动相液相色谱法流动相6 6 高效液相色谱仪高

2、效液相色谱仪7 7 高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱分离类型的选择8 8 高效液相色谱法应用实例高效液相色谱法应用实例9 9 液相制备色谱液相制备色谱10 10 毛细管电泳毛细管电泳3.13.1高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指一、定义：液相色谱法是指流动相为液体流动相为液体的色谱技术。的色谱技术。高效液相色谱是高效液相色谱是2020世纪世纪7070年代迅速发展起来的一项年代迅速发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱高效、快速的分离技术。（液相色谱+ +气相色谱理气相色谱理论论+ +高压泵、高效固定相高压泵、高效固定相+ +高灵敏检测器）。高灵敏检测器）

3、。二、特点二、特点1.1.高压高压: : 可达可达150350105 Pa2.2.高速高速: : 例，分离例，分离2020种氨基酸，经典色谱法要种氨基酸，经典色谱法要2020多小多小时，用时，用HPLCHPLC只需只需1 1小时小时. .3.3.高效高效：3 3万塔板万塔板/ /米（米（GC2000GC2000塔板塔板/ /米）米）4.4.高灵敏度高灵敏度： 紫外检测器紫外检测器1010-9-9 g g；荧光检测器；荧光检测器1010-11-11g g三、应用范围三、应用范围 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非

4、挥发性物质、热不稳定化合物、离子型对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，定程度的限制，据统计只有大约据统计只有大约20%20%的有机物能用气相色谱分的有机物能用气相色谱分析析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的占有机物

5、的70 - 70 - 80%80%。 。 因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。需要气化，不受试样挥发性的限制。从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。相色谱的异同点。解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。分离的。从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克

6、服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。等联用。二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定

7、性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，即可用于要试样能够制成溶液，即可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。差、相对分子量大的限制。3.23.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 与与GC GC 比较比较65/165/1；基本概念及理论基础与；基本概念及理论基础与GCGC一致；一致；主要区别：流动相不同主要区别：流动相不同. .液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：液相色谱中对色谱峰扩展及色谱分离影响的因素：一、柱内展宽一、柱内展

8、宽1.1.涡流扩散项涡流扩散项 ： H He e = 2d = 2dp p : :填充不均匀因子；填充不均匀因子；d dp p填充粒度直径填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，填充很均匀， 变得很小，所以变得很小，所以H He e值比较小值比较小。2.2.纵向扩散项纵向扩散项65/-165/-1： H Hd d = = C Cd dD Dm m/u/u； 当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于

9、分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数DmDm比在气体中小比在气体中小4-54-5个数量级，个数量级，在在LCLC中可忽略中可忽略,GC,GC中重要。中重要。 3、传质阻力项 组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。从而引起峰扩展。（1 1）固定相传质阻力项（主要发生在液液分配色谱中）固定相传质阻力项（主要发生在液液分配色谱中） 当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固当流动相中的试样分子扩散

10、进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。扩散系数。试样分子在固定液内的固定液的液膜厚度。容量因子）有关的系数是与式中sfssfssdkDdCHD(C) 33(2 采取措施：采取措施： 1 1）液）液- -液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。 2 2）采用扩散系数大的液相固定相。）采用扩散系数大的液相固定相。 3 3）减小流动相

11、的流速，改善传质。）减小流动相的流速，改善传质。（2 2）流动相传质阻力项）流动相传质阻力项( (二种形式二种形式: :在流动的流动相中的传在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质质和滞留的流动相中的传质) ) i. i.流动的流动相中的传质阻力项流动的流动相中的传质阻力项H Hm m 当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动移动速度不一样速度不一样从而引起峰形变宽。从而引起峰形变宽。.D(C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定

12、相的粒度。容量因子）函数。是与式中udkuDdCHmmmmpmm ii.ii.滞留的流动相中的传质阻力项滞留的流动相中的传质阻力项H Hsmsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。越

13、严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。.D,C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。分数及容量因子有关。相所占据部分的它与颗粒微孔中被流动是一常数式中uduDdCHmmsmmpmssm 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：纳为： H=A+B/H=A+B/u+Cuu+Cu 由于由于B/uB/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：，高效液相色谱的方程可写成： H=H=A+CuA+Cu)63()(2:222uDdCDdCDd

14、CudCdHsfsmpmsmpmmdp板高度的总变化色谱峰扩展所引起的塔1. 1. 提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度。提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度。 （选粒径小的、分布均匀的薄壳型担体（选粒径小的、分布均匀的薄壳型担体dp10m,5mdp10m,5m目前应用最广泛，提高装柱技术，湿目前应用最广泛，提高装柱技术，湿法匀浆法装柱）法匀浆法装柱）2. 2. 选粘度小、低流速的流动相（甲醇，约选粘度小、低流速的流动相（甲醇，约1ml/min1ml/min） 3. 3. 适当提高柱温以降低流动相粘度。适当提高柱温以降低流动相粘度。4 4、采用最佳流速。、采用最佳流速。5 5、减小柱外展宽。、减小

15、柱外展宽。其中，减小粒度是提高柱效能的最有效的方法。其中，减小粒度是提高柱效能的最有效的方法。HPLCHPLC与与GCGC的的H-uH-u曲线见曲线见图图3-13-1：（1 1）两者曲线形状相）两者曲线形状相似，都有一个似，都有一个H H最小值；最小值；（2 2）HPLCHPLC的的H H最小值比最小值比GCGC的最小值小一个数量的最小值小一个数量级以上，柱效更高；级以上，柱效更高；（3 3） HPLCHPLC的最佳流速的最佳流速u u比比GCGC的最佳流速的最佳流速u u也小也小一个数量级以上。一个数量级以上。二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰

16、扩展展. . a. a.柱前展宽：主要由进样所引起；柱前展宽：主要由进样所引起； 进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。注入进样器的液流中。 由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。起色谱峰不对称和展宽。 解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心12mm处。处。 b.b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起所引起. . 解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可解决：连接管的体积、检测器的死体积应

17、尽可能小能小. . Instrumental Analytical 仪器仪器 液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处有哪些主要不同之处?解解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中

18、还存在比较显著的滞留流另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。动相传质及柱外效应。 1、在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（ ）。 A 减小填料粒度 B 适当升高柱温 C 降低流动相的流速 D 增大流动相的流速 2、高效液相色谱中，可以忽略不计的影响色谱峰扩展的因素是（ ）。 A 涡流扩散项 B 纵向扩散项 C 传质阻力项 D 柱外展宽 3、在液相色谱中，纵向扩散项HdB/u较小，通常可以忽略不计。（ ） 4、要提高液相色谱分离的效率，必须提高柱内填料填装的均匀性和_以加快传质速率，其中_是提高柱效的最有效途径。练习练习3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理高效液

19、相色谱的主要类型及其分离原理类型类型：液：液-液色谱；液液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱离子色谱；空间排阻色谱一一.液液-液分配色谱法及化合键合相色谱液分配色谱法及化合键合相色谱 1.特点特点：a.流动相和固定相都是液体流动相和固定相都是液体 b.两相应互不相溶，有明显的分界面两相应互不相溶，有明显的分界面 2.分离机制：试样组分溶于流动相后分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之在固定相和流动相之间的相对间的相对溶解度存在差异溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。，溶质在两相间进行分配。 分离的顺序分离的顺序决定

20、于分配系数的大小，分配系数大的组分决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，而且保留值大，而且流动相的种类对分配系数有较大的影响流动相的种类对分配系数有较大的影响. 3.解决固定液流失问题方法：解决固定液流失问题方法：1）一般为了避免固定液的流失，对于亲水性的固）一般为了避免固定液的流失，对于亲水性的固定液常采用疏水性的流动相，而疏水性的固定定液常采用疏水性的流动相，而疏水性的固定相则采用亲水性的流动相，从而使固定液不至相则采用亲水性的流动相，从而使固定液不至于由于溶解于流动相而带走流失，即所谓的正于由于溶解于流动相而带走流失，即所谓的正反色谱法。反色谱法。 问题问题：何谓正相色谱及反相

21、色谱？在应用上有何谓正相色谱及反相色谱？在应用上有什么特点？什么特点？ 答：在色谱法中，流动相的极性小于固定液的极答：在色谱法中，流动相的极性小于固定液的极性，称为正相色谱；在色谱法中，流动相的极性，称为正相色谱；在色谱法中，流动相的极性大于固定液的极性，称为反相色谱。在应用性大于固定液的极性，称为反相色谱。在应用上，正相色谱主要用于分离极性物质；反相色上，正相色谱主要用于分离极性物质；反相色谱主要用于分离弱极性或非极性物质。谱主要用于分离弱极性或非极性物质。2）在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶）在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，

22、固定液也会解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液也会不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果。为了更好地解决固定相从载体上流失的坏等不良后果。为了更好地解决固定相从载体上流失的问题，采用化学键合固定相。问题，采用化学键合固定相。 问题问题：何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？：何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 答：利用化学反应将固定液的有机官能团答：利用化学反应将固定液的有机官能团共价共价键合在载键合在载体表面体表面的流离羟基上的流离羟基上形成的固定相称为化学键合固定相形成的固定相称为化学键合固定相。 优点：

23、固定相表面没有液坑优点：固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失，增加了色谱柱的稳定性及寿命；可多；无固定相流失，增加了色谱柱的稳定性及寿命；可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，可应用与以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，可应用与多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提，也有利多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。于配用灵敏的检测器和馏分的收集。 目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支，液广泛的一个分支，液-液分配色谱极少采用。

24、液分配色谱极少采用。化学键合固定相化学键合固定相 根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（可分为：硅氧碳键型（Si-O-C)；硅氧硅碳键；硅氧硅碳键型（型（Si-O-Si-C);硅碳键型（硅碳键型（Si-C)；硅氮键；硅氮键型（型（Si-N)。 硅烷化反应：硅烷化反应：二二.液液-固色谱法（或液固色谱法（或液-固吸附色谱法）固吸附色谱法）1.特点特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。：流动相为液体，固定相为吸附剂。2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。（溶质分子（溶质分子X与溶剂分子

25、与溶剂分子S对吸附剂表面竞争吸附）对吸附剂表面竞争吸附）3.结论结论69/-5： 如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应减小。显然，分配系数大的组分，显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大吸附剂对它的吸附力强，保留值就大.4.作用作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。适用分离相对分子质量中等油性试样。 b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。高的选择性。 缺点缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象. 三、离子对色谱法三、离子对色谱法 1.特点特点：对各种强极性的有机酸或有

26、机碱的分离，分离效能高，：对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便分析速度快，操作简便. 2.分离机制分离机制（P71）：将一种或多种与溶质电荷相反的离子）：将一种或多种与溶质电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为，采用液保留行为，采用液-液分配原理进行分离。液分配原理进行分离。 3.分离过程分离过程：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中带：流动相中待分离有机离子与固定相或

27、流动相中带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间进行分配进行分配. X+水相水相 (被测离子被测离子)+ Y水相水相(对离子对离子) X+Y有机有机相相（疏水）（疏水）4.4.分类分类 正相离子对色谱法：极性固定相正相离子对色谱法：极性固定相-非极性流动相。非极性流动相。 反相离子对色谱法：非极性的疏水固定相，含有反相离子对色谱法：非极性的疏水固定相，含有对离子对离子Y的甲醇水（或乙腈水）溶液作为的甲醇水（或乙腈水）溶液作为极性流动相极性流动相.试样离子试样离子X进入柱内以后，与对离子进入柱内以后，与对离子Y生成疏生成疏水性离子

28、对水性离子对XY，后者在疏水性固定相表面分，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。配或吸附。5.应用应用：解决了以往难分离混合物的分离问题：解决了以往难分离混合物的分离问题,诸如诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样试样.另外，还可借助离子对的生成给试样引入此另外，还可借助离子对的生成给试样引入此外吸收或发荧光的基团，以提高检测灵敏度。外吸收或发荧光的基团，以提高检测灵敏度。四四.离子交换色谱法离子交换色谱法 1.分离机制分离机制70/2；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中；离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交

29、换，依据这些离子对具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 2.适用范围适用范围70/3；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法进行分离。进行分离。离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆交换反应：子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆交换反应： )83()73(N3NM443树脂）（树脂）阴离子交换：树脂）（树脂）（阳离子交换：NRXClNRClXSOMaSOa3.结论结论：亲合力高的，在柱

30、中保留值就愈大，分配：亲合力高的，在柱中保留值就愈大，分配系数也愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相系数也愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。互作用愈强。 4.应用应用：a.分离离子或可离解成离子的化合物。分离离子或可离解成离子的化合物。 b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.五、离子色谱法五、离子色谱法这是这是20世纪世纪70年代中期发展年代中期发展起来的一项新的液相色谱法，起来的一项新的液相色谱法，很快发展成为水溶液中阴离子很快发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法。分析的最佳方法。 1.固定相固定相:离子交换树脂离子交换树脂 流动相流动相:电

31、解质溶液电解质溶液 检测器检测器:电导检测器电导检测器 主配件：抑制柱（抑制流动相主配件：抑制柱（抑制流动相中强电解质背景离子的干扰）中强电解质背景离子的干扰） 2. 流程图：流程图：fig3-2例：例：阴离子交换柱（分离柱）：阴离子交换柱（分离柱）：ROH + Na+Br-(待测待测) RBr- + Na+OH-（交换）（交换）R RBr-Br- + + Na+OHNa+OH ( (洗洗脱剂脱剂) ) R ROH-+ Na+ Br-OH-+ Na+ Br-（洗（洗脱脱）抑制柱（消除本底电导影响），则发生下列反应：抑制柱（消除本底电导影响），则发生下列反应：RH + Na+OH-(流动相流动相

32、) RNa+ + H2O RH + Na+Br-(流动相流动相) RNa+ + H+Br-可见，不仅大量碱转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有可见，不仅大量碱转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的酸，大大提高检测灵敏度。更大淌度的酸，大大提高检测灵敏度。3.分离机制分离机制 a.双柱型：化学抑制型离子色谱法。双柱型：化学抑制型离子色谱法。 b.单柱型：非抑制型单柱型：非抑制型. 问题问题：何谓化学抑制型离子交换色谱及非抑制型：何谓化学抑制型离子交换色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理。离子色谱？试述它们的基本原理。4.应用应用： 离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多离

33、子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速发展。组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速发展。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.六、空间排阻色谱法六、空间排阻色谱法 1.固定相：凝胶固定相：凝胶 2.机制机制73/-9：类似于分子筛作用，分离只与凝：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关大小有关. 排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分中太大

34、的分子不能进入胶孔而受到排阻，先中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，先出峰；组分中太小的分子可以进入所有胶体出峰；组分中太小的分子可以进入所有胶体微孔中，最后出峰。微孔中，最后出峰。 洗脱次序将取决于相对分子质量的大小，相洗脱次序将取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的先洗脱，相对分子质量小的对分子质量大的先洗脱，相对分子质量小的后洗脱。后洗脱。 分子的形状也对保留有重要的作用。分子的形状也对保留有重要的作用。3.分离示意图，分离示意图，fig3-3 a.排斥极限排斥极限A点点74/2;3: b.全渗透极限全渗透极限B点点74/2;6: 相对分子质量介于上述相对分子质量介于上述 两个极限之

35、间的化合物，两个极限之间的化合物， 将按相对分子质量降低的将按相对分子质量降低的 次序被洗脱而可以分离次序被洗脱而可以分离. 4.特点特点75/2;3:1）试样色谱峰全部在溶剂的保留时）试样色谱峰全部在溶剂的保留时间前出峰。间前出峰。2）用于分离相对分子质量大的化合）用于分离相对分子质量大的化合物（约为物（约为2000以上）；以上）；3）只能分离相对分子质）只能分离相对分子质量差别在量差别在10%以上的分子。以上的分子。液相色谱有几种类型液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么它们的保留机理是什么? 在这些类型的在这些类型的应用中应用中,最适宜分离的物质是什么最适宜分离的物质是什么?解解:液相

36、色谱有以下几种类型液相色谱有以下几种类型:液液-液分配色谱液分配色谱; 液液-固吸附色谱固吸附色谱; 化学键合色谱化学键合色谱;离子交换色谱离子交换色谱; 离子对色谱离子对色谱; 空间排阻色谱等空间排阻色谱等.液液-固吸附色谱是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实固吸附色谱是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的现分离的.最适宜分离的物质为中等相对分子质量的油溶性试最适宜分离的物质为中等相对分子质量的油溶性试样，凡是能够用薄层色谱分离的物质均可用此法分离。样，凡是能够用薄层色谱分离的物质均可用此法分离。其中其中;液液-液分配色谱的保留机理是通过组分在固定相和流动相液分配色谱的保留机理

37、是通过组分在固定相和流动相间的多次分配进行分离的。可以分离各种无机、有机化合物。间的多次分配进行分离的。可以分离各种无机、有机化合物。化学键合色谱中由于键合基团不能全部覆盖具有吸附能力的载化学键合色谱中由于键合基团不能全部覆盖具有吸附能力的载体体,所以同时遵循吸附和分配的机理所以同时遵循吸附和分配的机理,最适宜分离的物质为与液最适宜分离的物质为与液-液色谱相同。液色谱相同。离子交换色谱和离子色谱是通过组分与固定相间亲合力差别而离子交换色谱和离子色谱是通过组分与固定相间亲合力差别而实现分离的实现分离的.各种离子及在溶液中能够离解的物质均可实现分各种离子及在溶液中能够离解的物质均可实现分离，包括无

38、机化合物、有机物及生物分子，如氨基酸、核酸及离，包括无机化合物、有机物及生物分子，如氨基酸、核酸及蛋白质等。蛋白质等。在离子对色谱色谱中在离子对色谱色谱中,样品组分进入色谱柱后样品组分进入色谱柱后,组分的离子与对离组分的离子与对离子相互作用生成中性化合物子相互作用生成中性化合物,从而被固定相分配或吸附进而实现从而被固定相分配或吸附进而实现分离的分离的.各种有机酸碱特别是核酸、核苷、生物碱等的分离是离各种有机酸碱特别是核酸、核苷、生物碱等的分离是离子对色谱的特点。子对色谱的特点。空间排阻色谱是利用凝胶固定相的孔径与被分离组分分子间的相空间排阻色谱是利用凝胶固定相的孔径与被分离组分分子间的相对大小

39、关系对大小关系,而分离、分析的方法。最适宜分离的物质是：而分离、分析的方法。最适宜分离的物质是：用于用于分离相对分子质量大的化合物（约为分离相对分子质量大的化合物（约为20002000以上）；只能分以上）；只能分离相对分子质量差别在离相对分子质量差别在10%10%以上的分子。以上的分子。另外尚有手性色谱、胶束色谱、环糊精色谱及亲合色谱等机理。另外尚有手性色谱、胶束色谱、环糊精色谱及亲合色谱等机理。3.4 液相色谱法固定相液相色谱法固定相 色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键.一、液一、液-液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法、键

40、合相色谱法及离子对色谱法固定相1.全多孔型担体：直径小于全多孔型担体：直径小于10m,由由nm级的硅胶微粒堆聚而级的硅胶微粒堆聚而成为成为5m直径的全多孔型担体。颗粒小，柱效高。直径的全多孔型担体。颗粒小，柱效高。2.表层多孔型担体：直径为表层多孔型担体：直径为3040m的实心核的实心核(玻璃微珠玻璃微珠)，表层上附有一层厚度约为表层上附有一层厚度约为12 m的多孔硅胶，填柱容易，的多孔硅胶，填柱容易，重现性好，但试样容量低。目前重现性好，但试样容量低。目前510m直径是使用最广直径是使用最广泛的高效填料。泛的高效填料。3.化学键合固定相（化学键合固定相（P76及及P69） 定义：用化学反应的

41、方法通过化学键把有机分子结合到担定义：用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面体表面. 化学键合固定相化学键合固定相 根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（可分为：硅氧碳键型（Si-O-C)；硅氧硅碳键；硅氧硅碳键型（型（Si-O-Si-C);硅碳键型（硅碳键型（Si-C)；硅氮键；硅氮键型（型（Si-N)。 硅烷化反应：硅烷化反应：化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点： （1）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多； （2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；）无

42、固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； （3）可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，）可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；应用于多种色谱类型及样品的分析； （4）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。馏分的收集。分离机制分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量的多少而各有侧重的多少而各有侧重.二、液二、液-固吸附色谱法固定相固吸附色谱法固定相 目前较常

43、用目前较常用5-10m的硅胶微粒（全多孔型）的硅胶微粒（全多孔型）.三、离子交换色谱法固定相三、离子交换色谱法固定相 1.薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂1%离子离子交换树脂交换树脂. 2.离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。惰性担体表面。 a.键合薄壳型：担体，薄壳玻珠；键合薄壳型：担体，薄壳玻珠； b.键合微粒担体型：担体，微粒硅胶键合微粒担体型：担体，微粒硅胶.四、排阻色谱法固定相四、排阻色谱法固定相 a.软质凝胶：葡萄糖凝胶；琼脂糖凝胶；软质凝胶：葡萄糖

44、凝胶；琼脂糖凝胶；(水流动相水流动相,常压常压) b.半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶；半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶；(有机溶剂，较高压有机溶剂，较高压) c.硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；(高速高速)3.5 液相色谱法流动相液相色谱法流动相1.重要性：重要性：GC载气仅三四种，要提高柱效选载气仅三四种，要提高柱效选择性，主要是改变固定相的性质；择性，主要是改变固定相的性质； LC则不同，当固定相选定时，流动相的种则不同，当固定相选定时，流动相的种类，配比能显著地影响分离效果，因此类，配比能显著地影响分离效果，因此流流动相的选择很重要。动相的选择很重要。2.选择流动相

45、应注意的因素选择流动相应注意的因素79/2：5点点， 选择流动相的注意因素：选择流动相的注意因素：（1）流动相的纯度：一般是采用分析纯试剂，必）流动相的纯度：一般是采用分析纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去干扰的杂质。要时需进一步纯化，以除去干扰的杂质。（2）应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变）应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变化的溶剂。（固定相不能吸附溶剂或与流动相互化的溶剂。（固定相不能吸附溶剂或与流动相互溶。）溶。）（3）对试样要有适宜的溶解度，否则会在柱头易）对试样要有适宜的溶解度，否则会在柱头易产生沉淀。产生沉淀。（4）溶剂的粘度小些为好，否则会降低试样组分）溶剂的粘度小些为

46、好，否则会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。（5）应柱检测器相匹配（溶剂不能被相应的检）应柱检测器相匹配（溶剂不能被相应的检测器检测出来）测器检测出来）3.溶剂的选择溶剂的选择79/-3： a. 依据依据：溶剂的极性是重要依据。：溶剂的极性是重要依据。 b.溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。 c.采用多元组合溶剂系统作为流动相（底采用多元组合溶剂系统作为流动相（底液和洗脱液）（底剂决定基本的色谱分离液和洗脱液）（底剂决定基本的色谱分离情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并对情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并对几

47、个具有选择性的分离作用）几个具有选择性的分离作用） d.根据不同的方法选择合适的底液和洗脱根据不同的方法选择合适的底液和洗脱液液 选用溶剂的依据：溶剂的极性。选用溶剂的依据：溶剂的极性。 正相色谱：底剂（弱极性）洗脱剂（极性较强）正相色谱：底剂（弱极性）洗脱剂（极性较强） 反相色谱：水（主体）有机溶剂调节剂。反相色谱：水（主体）有机溶剂调节剂。 离子交换色谱：组分保留值通过流动相的离子强离子交换色谱：组分保留值通过流动相的离子强度（盐的浓度）和度（盐的浓度）和pH来控制。增加盐的浓度，来控制。增加盐的浓度，保留值降低；阳离子交换柱流动相保留值降低；阳离子交换柱流动相pH增加，保增加，保留值增加

48、，阴离子交换柱相反。留值增加，阴离子交换柱相反。 排阻色谱：所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，排阻色谱：所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。3-6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph液相色谱仪（液相色谱仪（2）液相色谱仪（液相色谱仪（3）液相色谱仪（液相色谱仪（4）一、概述一、概述80/1：高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、：高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温

49、器、记录仪等主要部件。等主要部件。 二、结构示意图，二、结构示意图，fig3-4.三、部件介绍三、部件介绍 1.高压泵（压力高压泵（压力150 350105 Pa）要求要求：a.流量要稳定；流量要稳定；80/-1b.压力平稳无脉动；压力平稳无脉动；81/2.c.对流速要有一定的可调范围对流速要有一定的可调范围.81/4.动画 类型：类型： a .往复式柱塞泵往复式柱塞泵是目前广泛使用的是目前广泛使用的恒流泵恒流泵. 机理机理特点特点81/-2;6: 1)不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供连续供给恒定体积的流动相给恒定体积的流动相；

50、 2）可方便地通过改变柱塞冲程的大小或往复的频率来调节流）可方便地通过改变柱塞冲程的大小或往复的频率来调节流量；量； 3）由于死体积小（约）由于死体积小（约0.1mL），更换溶剂方便，很适用于梯），更换溶剂方便，很适用于梯度洗提度洗提. 不足不足： 1）输出有脉冲波动，会干扰检测器正常工作；）输出有脉冲波动，会干扰检测器正常工作；2）由于产生基）由于产生基线噪声而影响检测的灵敏度线噪声而影响检测的灵敏度.b.气动放大泵气动放大泵恒压泵恒压泵 原理：原理： p1SA = p2SB 其工作原理其工作原理:这是一种恒压这是一种恒压泵。泵。 特点特点82/-6: 1）能供给无脉冲的稳定流）能供给无脉冲

51、的稳定流量的输出量的输出. 2）液缸体积大，更换流动）液缸体积大，更换流动相不方便；相不方便； 3）不便于梯度洗提）不便于梯度洗提. 4）适合匀浆法填装色谱柱。）适合匀浆法填装色谱柱。2.梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置82/ a.作用：作用：与与GC 中的程序升温一样中的程序升温一样.（P22、23） b.定义定义83/1：所谓梯度洗提，就是：所谓梯度洗提，就是载液中含有两种以上载液中含有两种以上不同极性的溶剂，不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改载液中溶剂的配比和

52、极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以变被分离组分的分离因素，以提高分离效果提高分离效果。应用梯度。应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，还可提高洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，还可提高最小检测量和定量分析的精度。最小检测量和定量分析的精度。 外梯度外梯度（低压梯度）：先混合后输入色谱柱；（低压梯度）：先混合后输入色谱柱； 内梯度内梯度（高压梯度）：先泵入梯度混合室再入色谱柱；（高压梯度）：先泵入梯度混合室再入色谱柱；何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？解：在一个分析周期内，按一定程序不断改

53、变流动相的组成解：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提是改进液相色谱分离的重要手或浓度配比，称为梯度洗提是改进液相色谱分离的重要手段段梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度或离子强度，而后者改变的温度程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段3.进样装置进样装置 a.重要性重要性83/1：进样方式及试样体积对柱效有很大进样方式及试样体积对柱效有很大影响影响.要获得良好的分离效果和重现性，需要将

54、要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样试样“浓缩浓缩”地瞬间注入色谱柱入担体的中心成地瞬间注入色谱柱入担体的中心成一个点。一个点。 b.进样方式进样方式 1）注射器进样装置：）注射器进样装置： 由于不能承受高压，所以需用停流进样方法，但由于不能承受高压，所以需用停流进样方法，但该方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性该方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差亦较差.2）高压定量进样阀高压定量进样阀通过进样阀（通常是六通阀）直接向压力系统内进样而不通过进样阀（通常是六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相的一种装置（必停止流动相的一种装置（fig3-7） a.进样准备：进样准备：1

55、和和6，2和和3连通，试样由连通，试样由5、4注入定量管；注入定量管；b.进样：阀芯顺时针进样：阀芯顺时针旋转旋转600，这时，这时1和和2，3和和4，5和和6连通，试连通，试样送入柱中样送入柱中.特点：特点：进样准确，重现进样准确，重现性好，适于定量分析性好，适于定量分析.高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？解：在液相色谱中为了承受高压，常常采用停流进样与高压解：在液相色谱中为了承受高压，常常采用停流进样与高压定量进样阀进样的方式定量进样阀进样的方式4.色谱柱色谱柱 a.参数：参数：id， 4.6或或3.9 mm； L=15

56、-30cm； 填料颗粒度，填料颗粒度，5-10 m； n=5000-10000 b.发展趋势发展趋势 1）减小填料粒度，）减小填料粒度，3-5 m； 2）减小柱内径，）减小柱内径， 1mm； c.装填方式装填方式 1）干法，填料粒度大于）干法，填料粒度大于20 m； 2）湿法（匀浆法），粒度小于）湿法（匀浆法），粒度小于20 m；(生成生成匀浆，高压装柱）匀浆，高压装柱）5.检测器检测器 要求要求84/-1：具有灵敏度高、重现性好、响应快、现性范：具有灵敏度高、重现性好、响应快、现性范围宽、适用范围广、对流动相和温度波动不敏感、死体围宽、适用范围广、对流动相和温度波动不敏感、死体积小等特点积小

57、等特点.a.紫外光度检测器紫外光度检测器85/11）原理，被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，）原理，被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律。组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律。2）光路图，图）光路图，图3-8；3）特点特点85/3；a.具有很高灵具有很高灵敏度；敏度； b. 对温度和流速不敏感，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提可用于梯度洗提. 缺点缺点：不适用于对紫外光：不适用于对紫外光不吸收的试样不吸收的试样.4）发展）发展85-1；光电二极管；光电二极管211/1024个个阵列检测器阵列检测器. 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；

58、光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：211/1024个二极管阵列，各检个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器b.荧光检测器荧光检测器86/ 1）原理：许多物质，特别是具有对称共轭结构的）原理：许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，某些不发射荧光的物质亦可光波长较长的荧光，某些不发射荧光的物质亦可通过通过化学衍生化学衍生转变成能发出荧光的物质而得到检转变成能发出荧光的物

59、质而得到检测。测。当入射光强度、试样池长度不变时，稀溶液当入射光强度、试样池长度不变时，稀溶液的荧光强度与溶液浓度成正比。的荧光强度与溶液浓度成正比。 2）光路图：图）光路图：图3-11； 3）特点：荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度）特点：荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高要高2个数量级。但线性范围仅个数量级。但线性范围仅103，利用可调谐，利用可调谐的激光作光源（的激光作光源（激光诱导荧光激光诱导荧光）可使检测灵敏度）可使检测灵敏度和准确度都得到提高。和准确度都得到提高。荧光检测器（fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性高灵敏度、高选择性应用：应用：对多环芳烃

60、，维对多环芳烃，维生素生素B、黄曲霉素、卟、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物、氨基酸、甾类化合物等有响应物等有响应 c.差示折光检测器差示折光检测器通用型通用型87/1）原理：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测）原理：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。2）类型：偏转式；反射式）类型：偏转式；反射式3）定量方法：偏转式是利用测量折射角偏转值的大小定量方法：偏转式是利用测量折