日本岛津UV2550分光光度计 操作培训技巧

1、v1 1山东安和安全技术研究院有限公司山东安和安全技术研究院有限公司检测部检测部 Tel: (0543) 3065070E_mail:岛津UV2550紫外/可见分光光度计操作培训v2 2v紫外紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱v吸收光谱的测量吸收光谱的测量-Lambert-BeerLambert-Beer 定律定律v紫外紫外- -可见分光光度计仪器组成可见分光光度计仪器组成v分析条件选择分析条件选择vUV-VisUV-Vis分光光度法的应用分光光度法的应用v紫外紫外- -可见分光光度计的维护和保养可见分光光度计的维护和保养UV-VisUV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特

2、性。方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。UV-VisUV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160780nm. .UV-VisUV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)(UV)为四大波谱之一，是为四大波谱之一，是 鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。 目录目录3Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited3 3紫外紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱4Shimad

3、zu International Trading (Shanghai) Co. Limited4 4电磁波谱电磁波谱g -X-射线紫外可见红外 微波无线电200 400 800 3200(nm)波长波长真空紫外近红外核磁共振 波长越短，能量越高5Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited5 5一、分子吸收光谱的形成一、分子吸收光谱的形成1. 过程：运动的分子外层电子过程：运动的分子外层电子-吸收外来外来辐射吸收外来外来辐射-产生电子能产生电子能级跃迁级跃迁-分子吸收谱。分子吸收谱。 h*MhMt0II 基态 E0激发态 E1DE

4、= E1 - E0 = h能量激发激发e能量差DE6Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited6 62. 2. 能级组成：除了电子能级能级组成：除了电子能级(Electron energy level)(Electron energy level)外，分子吸收能量外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动(Vibration)(Vibration)能级和转能级和转动动(Rotation)(Rotation)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振能级的跃迁！据量子力学理论，分子

5、的振- -转跃迁也是量转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化D DE E为各种形式为各种形式能量变化的总和：能量变化的总和： 其中其中D DEeEe最大：最大：1-10 eV1-10 eV; ; D DEvEv次之：次之：0.05-1 eV0.05-1 eV; ; D DErEr最小：最小： 0.05 eV0.05 eV rve7Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited7 7能级跃迁示意图能级跃迁示意图电磁波与分子相互作用时产生能级跃迁：能级能级振动能级跃迁振

6、动能级跃迁 转动能级跃迁转动能级跃迁v1v2v0543210电子能级跃迁电子能级跃迁E1E0v0v1v2E = h 其中其中 h 为普朗克常数为普朗克常数 (6.626 10-34 焦耳焦耳 秒）秒） 为频率为频率 8Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited8 8各轨道能级高低顺序：各轨道能级高低顺序： n n* * *；可能的跃迁类型：可能的跃迁类型： - - * *； - - * *； - - * *；n-n- * *； - - * *；n-n- * *9Shimadzu International Trading (Sha

7、nghai) Co. Limited9 9 - *：C-H共价键，如共价键，如CH4（115nm）；C-C键，如键，如C1H6(135nm)，处于，处于 真空紫外区；真空紫外区； - * : 和和 - *跃迁：尽管所需能量比上述跃迁：尽管所需能量比上述 - *跃迁能量小，但波长仍处于跃迁能量小，但波长仍处于 真空紫外区；真空紫外区；n- *：含有孤对电子的分子，如含有孤对电子的分子，如H1O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl (173nm);CH3I(158nm)；(CH3)1S(119nm)；(CH3)1O(184nm) CH3NH1(115nm)；(CH3)3N(117n

8、m)，可见，大多数波长仍小于可见，大多数波长仍小于 200nm，处于近紫外区。，处于近紫外区。 以上四种跃迁都与以上四种跃迁都与 成键和反键轨道有关（成键和反键轨道有关（ - *， - *， - *和和n- *），跃迁能量较高，这些跃迁），跃迁能量较高，这些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。而在此不加讨论。 只有只有 - *和和n- *两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。 10Shimadzu In

9、ternational Trading (Shanghai) Co. Limited1010几个概念：几个概念：生色团生色团（Chromogenesis groupChromogenesis group）：）： 分子中含有非键或分子中含有非键或 键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起n-n- * * 和和 - - * *跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。助色团助色团（Auxochromous groupAuxochromous group） ： 含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高

10、吸含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。收强度的一些官能团，称之为助色团。红移红移或或蓝移蓝移（Redshift or blueshiftRedshift or blueshift）：）： 在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向（向长波方向（红移红移）或短波方向移动（）或短波方向移动（蓝移蓝移）的现象。）的现象。11Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1111吸收光谱的测量吸收光谱的测量Lambert-

11、BeerLambert-Beer 定律定律12Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1212一、透射率一、透射率T% 入射光I0透射光 I光程长b 透射率 T% =II0 100%13Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1313 当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成与其浓度和液层厚度成正比，即正比，即k 为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。 当浓度以

12、当浓度以 g/L 表示时，称表示时，称 k 为吸光系数，以为吸光系数，以 a 表示，即表示，即 当浓度以当浓度以mol/L表示时，称表示时，称 k 为摩尔吸光系数，以为摩尔吸光系数，以 表示，即表示，即 比比 a 更常用。更常用。 越大，表示方法的灵敏度越高。越大，表示方法的灵敏度越高。 与波长有关，因此，与波长有关，因此， 常以常以 表示。表示。kbcA abcA bcA14Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1414 样品吸光度样品吸光度 A 与光程与光程 b 总是成正比。但当总是成正比。但当 b 一定时，一定时，A 与

13、与 c 并不总并不总是成正比，即偏离是成正比，即偏离 L-B 定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。1. 样品性质影响样品性质影响a）待测物高浓度）待测物高浓度-吸收质点间隔变小吸收质点间隔变小质点间相互作用质点间相互作用对特定辐射对特定辐射 的吸收能力发生变化的吸收能力发生变化- 变化；变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配 体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；）

14、溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。 三、偏离三、偏离 L-B L-B 定律的因素定律的因素15Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited15152. 2. 仪器因素仪器因素 仪器因素包括仪器因素包括光源稳定性光源稳定性以及以及入射光的单色性入射光的单色性等。等。a a）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。b）谱带宽度与狭缝宽度：）谱带宽度与狭缝宽度：“

15、单色光单色光”仅是理想情况，经分光元件色仅是理想情况，经分光元件色散所得的散所得的“单色光单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带宽度即谱带宽度)。单色光的。单色光的“纯度纯度”与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。围越小，单色性越好。16Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1616紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计仪器组成仪器组成17Shimadzu International Trading (Shanghai)

16、 Co. Limited1717UV示意图18Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1818 紫外紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。一、光源一、光源 对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。1. 钨及碘钨灯：钨及碘钨灯：3401500 nm，多用在可见光区；，多用在可见光区；2. 氢灯和氘灯：氢灯和氘灯：160375nm，多用在紫外区。，多用在紫外区。二、单色器二、

17、单色器(Monochromator) 与原子吸收光度仪不同，在与原子吸收光度仪不同，在UV-Vis光度计中，单色器通常置于吸收光度计中，单色器通常置于吸收池的前面！池的前面！（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解）（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解）三、吸收池三、吸收池(Cell，Container)： 用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。四、检测器：四、检测器： 硅光电池、硅光电

18、池、PMT、PDA19Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited1919UV2550UV2550光路图光路图20Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2020分光光度计的校正分光光度计的校正 当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对其进行校正。其进行校正。波长标度校正：波长标度校正： 使用镨使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进

19、行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度标度校正：吸光度标度校正： 采用采用 K2CrO4 标准液校正（在标准液校正（在15oC时，于不同波长处测定时，于不同波长处测定0.04000g/L的的 KOH 溶液溶液（0.05mol/L）的吸光度的吸光度 A，调整光度计使其，调整光度计使其A 达到指定的吸达到指定的吸光度。光度。21Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2121分析条件选择分析条件选择22Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Li

20、mited2222一、仪器测量条件一、仪器测量条件 由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。时，误差更大。由由L-B定律：定律：微分后得：微分后得： 将上两式相比，并将将上两式相比，并将 dT 和和 dc 分别换为分别换为D DT 和和 D Dc，得，得 当相对误差当相对误差 D Dc/c 最小时，求得最小时，求得T=0.368 或或 A=0.434。即当。即当A=0.434 时，吸光度读数误差最小！时，吸光度读数误差最小！ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制来控制A

21、的读数在的读数在0.151.00范范围内。围内。 bcTAlgbdcTdTTd434. 0lgTTTcclg434. 0DD23Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2323二、反应条件选择二、反应条件选择 显色剂的选择原则：显色剂的选择原则： 使配合物吸收系数使配合物吸收系数 最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2. 2. 显色剂用量：显色剂用量： 配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格配

22、位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。控制。3. 3. 溶液酸度：配位数和水解等与溶液酸度：配位数和水解等与 pH pH 有关。有关。4. 4. 显色时间、温度、放置时间等。显色时间、温度、放置时间等。24Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2424三、参比液选择三、参比液选择 1.1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比； 2.2.试剂参比：

23、当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；参比（不加待测物）； 3.3.试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。可以试样作参比（不能加显色剂）。25Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2525四、干扰消除四、干扰消除1. 控制酸度：控制酸度： 配合物稳定性与配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，有关

24、，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物生成稳定有色配合物，而与，而与Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。等离子生成的有色物不稳定。2. 选择掩蔽剂选择掩蔽剂3. 合适测量波长合适测量波长4. 干扰物分离干扰物分离5. 导数光谱及双波长技术导数光谱及双波长技术26Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2626紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法的应用的应用27Shima

25、dzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2727一、定性分析一、定性分析 不同物质结构不同或者说其分子能不同物质结构不同或者说其分子能级的能量级的能量(各种能级能量总和各种能级能量总和)或能量间或能量间隔各异，因此不同物质将隔各异，因此不同物质将选择性选择性地吸收地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。定性分析的基础。 定性分析具体做法定性分析具体做法是让不同波长的是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度其对不同波长光的

26、吸收程度(吸光度吸光度A)，以吸光度以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置峰强度、位置及数目等及数目等)研究分子结构。研究分子结构。28Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited2828 - -胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮 几种化合物的分子吸几种化合物的分子吸收光谱图收光谱图29Shimadzu International Trading (Shanghai) C

27、o. Limited2929二、定量分析二、定量分析1. 1. 单组份定量方法单组份定量方法 1）标准曲线法）标准曲线法(职业卫生检测中常用职业卫生检测中常用)： 用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的条件用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与待测组分相同的条件下，测量吸光度，用吸光度对样品浓度绘制标准曲线标准曲线的斜率下，测量吸光度，用吸光度对样品浓度绘制标准曲线标准曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时，要用与绘制标准曲线完全相同的条件测量吸光度，然后根据吸光度在标准曲线上直接读线完全相同的条件测量

28、吸光度，然后根据吸光度在标准曲线上直接读出样品组分的浓度。出样品组分的浓度。 2）标准对比法：）标准对比法： 该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由，然后由Ax=kcx求出求出cx 该法只有在测定浓度范围内遵守该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且定律，且cx与与cs大致相当时，才大致相当时，才可得到准确结果。可得到准确结果。30Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited3030二、定量分

29、析步骤（标准曲线法）二、定量分析步骤（标准曲线法）先开主机，然后再打开先开主机，然后再打开UVPROBEUVPROBE软件；软件；启动启动UVPROBEUVPROBE以后，点击界面下方以后，点击界面下方“连接连接”进行仪器连接，进行仪器连接，仪器进行连接检查，待检查全部通过后，点击仪器进行连接检查，待检查全部通过后，点击“OK”OK”点击点击“光度测定光度测定”；点击点击“方法方法”，波长设定为通过光谱检测到所测样品的最，波长设定为通过光谱检测到所测样品的最大吸收波长大吸收波长, ,然后加入波长，类型多选择为然后加入波长，类型多选择为“多点多点”，WL1=WL1=最大波长。最大波长。 点击点击

30、“下一步下一步”，（注：根据所测样品，（注：根据所测样品对相应的参数进行设定），对相应的参数进行设定），“方法方法”设定完后，点击设定完后，点击“关关闭闭”；将两个空白参比放入光束吸收池架；将两个空白参比放入光束吸收池架；点击点击“自动调零自动调零”；1.1.双击标准表中的任意位置激活标准表，在表头位置将显示双击标准表中的任意位置激活标准表，在表头位置将显示激活；激活；31Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited3131点击下拉菜单中的点击下拉菜单中的II- - 扣空白；扣空白；在标准表中依次输入标准系列在标准表中依次输入标准系

31、列IDID；读取标准样品：将两个空白参比放入光束吸收池架，点击读取标准样品：将两个空白参比放入光束吸收池架，点击“自动调零自动调零”，然后放入样品，输入样品浓度，依次进行，然后放入样品，输入样品浓度，依次进行“读取读取”。样品的浓度读取完后，在。样品的浓度读取完后，在“标准曲线标准曲线”表中点表中点击击“右键右键”-“-“属性属性”中选择中选择“方程式方程式”、“相关系数相关系数”，查看标准曲线；查看标准曲线；样品读取：点击样品表中的任意位置激活标准表，在表头样品读取：点击样品表中的任意位置激活标准表，在表头位置将显示激活；位置将显示激活；在样品表中输入样品在样品表中输入样品IDID，放入待测

32、样品，进行，放入待测样品，进行“读取读取 ” ”。打印结果：点击文件打印结果：点击文件- -打印打印- -（选择打印标准表或样品表）（选择打印标准表或样品表）关机：点击操作界面关机：点击操作界面“断开断开”，然后关闭仪器电源，关闭，然后关闭仪器电源，关闭操作软件，关闭电脑，将比色皿倒扣放置保存。操作软件，关闭电脑，将比色皿倒扣放置保存。32Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited3232紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计的维护与保养的维护与保养33Shimadzu International Trading (Shang

33、hai) Co. Limited3333一、环境要求一、环境要求、使用工作温度：、使用工作温度：15153535，湿度：，湿度：454580%80%，如果温度高于，如果温度高于3030，则湿度必须小于则湿度必须小于70%70%、避免日光直射、避免日光直射、避免震动、避免震动、避免强磁场，电场、避免强磁场，电场、远离腐蚀性气体，并避免置于任何可能导致紫外区吸收的含有、远离腐蚀性气体，并避免置于任何可能导致紫外区吸收的含有机机/ /无机试剂气体的区域无机试剂气体的区域、避免脏污、多尘环境、避免脏污、多尘环境34Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited3434二、工作台要求二、工作台要求 、可承受压力、可承受压力 35Kg+25Kg 35Kg+25Kg（PCPC） 、最小尺寸、最小尺寸 ：长：长：1120mm1120mm，宽：，宽：710mm710mm，高：，高：520mm520mm三、电源要求三、电源要求 、供电电压：、供电电压：100/120/220/230/240V 100/120/220/230/240V 交流交流5% 50/60Hz5% 50/60Hz 、功率消耗：约、功率消耗：约190VA190VA 、