第九章 酶的非水相催化

1、 有机介质中的酶催化是指酶在有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水含有一定量水的有机的有机溶剂中进行的催化反应。溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶催化作用。 酶在气相介质中进行的催化反应。酶在气相介质中进行的催化反应。 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。酶催化反应。 酶在超临界流体中进行的催化反应。酶在超临界流体中进行的催化反应。 超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。流体。 在离子液中

2、进行的催化作用。在离子液中进行的催化作用。 离子液（离子液（ionic liquidsionic liquids）是由有机阳离子与有机）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐（无机）阴离子构成的，在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。类，挥发性低、稳定性好。6.2 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 （1 1）微水介质体系）微水介质体系( (含水量一含水量一般小于般小于2%)2%)酶以酶以冻干粉冻干粉或或固定化酶固定化酶的形式的形式悬悬浮于有机溶剂浮于有机溶剂中，在悬浮状态下中，在悬浮状态下进行反应进行

3、反应。（4 4）胶束体系）胶束体系（5 5）反胶束体系）反胶束体系反相胶束与生物膜有相似之处适用于生物膜表面反相胶束与生物膜有相似之处适用于生物膜表面或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质或与膜结合的酶的结构、催化特性和动力学性质研究研究。（酶被限制在含水的微环境中，而底物和（酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束）看图正、反胶束体系产物可以自由进出胶束）看图正、反胶束体系“紧密紧密”：酶分子内的氢键：酶分子内的氢键“开启开启”：酶分子间的氢键：酶分子间的氢键a不同酶需水量不同不同酶需水量不同b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水

4、性越强，需水量越少溶剂疏水性越强，需水量越少生物催化剂必需水层（1 1）必需水（）必需水（essential wateressential water）：）： 紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少最少量水。（1） 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g（水/酶）：一个酶分子周围有0-60个水分子，蛋白质自由度无，酶活无（2） 与表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)：一个酶分子周围有60-220个水分子，蛋白质自由度上升，显示出酶活（3） 凝聚到表面相互作用较弱的部位（0.250.38g/g）：一个酶分子周围有220-300个水分子，蛋白质自由度上升，最大酶活（4）

5、 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。：酶分子周围的水分子达到300以上，酶活降低，自由度最大干燥的酶水合过程：干燥的酶水合过程：有机溶剂的极性有机溶剂的极性lgP 极性参数极性参数P溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数 研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。用有机溶剂极性参数lgP描述有机溶剂的极性与酶活力之间的关系溶剂极性对酶活性影响的规律（溶剂极性对酶活性影响的规律（Laane规律）规律）lglgP P性质性质水中溶解度水中溶解度/% /% (2

6、0)(20)对酶活性的影响对酶活性的影响2 2 极性溶剂极性溶剂0.40.4容易使酶失活，较少使容易使酶失活，较少使用用2 2，4 4中等极性中等极性0.040.040.40.4酶的活性难以预测，小酶的活性难以预测，小心使用。可以表现酶活心使用。可以表现酶活4 4非极性非极性0.040.04不会引起酶的变性，能不会引起酶的变性，能保持酶的高活性保持酶的高活性（1 1）有机溶剂对酶）有机溶剂对酶必需水必需水的影响的影响n极性弱的溶剂：影响小n极性强的溶剂：夺取酶必需水n疏水性溶剂：不易溶解吸附酶必需水n酶的失水与溶剂的极性参数极性参数（lgP）和介电常数介电常数（）相关，与系统中底物的极性、底物

7、浓度底物的极性、底物浓度和含水量含水量均有关系PSn催化过程：nSE-SE-PP （水相反应）nSwater shellE-SE-PPorganic phase （非水介质）n主要推动力：n底物-酶之间的结合能Organic SolventE-SE-P底物分子底物分子必须先进入酶分子的必须先进入酶分子的必需水层必需水层，再进入到酶活性中心完成催，再进入到酶活性中心完成催化过程，化过程，产物产物同样需要先进入水层再转移到反应介质。同样需要先进入水层再转移到反应介质。（2 2）有机溶剂对）有机溶剂对底物和产物分配底物和产物分配的影响的影响+底物与有机介质的极性差异NAcLPheOEtNAcLSer

8、OEt疏水性底物疏水性底物亲水性底物亲水性底物叔丁醇或叔丁胺亲水性溶剂亲水性溶剂CH2Cl2疏水性溶剂疏水性溶剂subtilisin 反应快反应快反应快反应快许多酶活性中心是疏水性疏水性的，容易与疏水性底物疏水性底物结合进行反应，疏水性底物容易从水中析出到达疏水性活性中心。 在疏水性强的有机溶剂中，疏水性底物与有机溶剂间的相互相互作用增强作用增强，底物从溶剂中到达活性中心比在水中困难，从而酶酶催化反应速度减慢催化反应速度减慢。极性小极性小疏水性强疏水性强底物在有机溶剂中溶解度大难于进入必需水层极性大极性大亲水性强亲水性强底物在有机溶剂中溶解度小，底物浓度降低有机溶剂有机溶剂 催化速度降低催化速

9、度降低适宜适宜lgP： lgP 5（疏水性底物）（疏水性底物）n有机溶剂对酶催化反应的影响：n酶的活性和稳定性n酶的底物特异性、对映体选择性、潜手性选择性、位置选择性、化学键选择性n原因：n与必需水作用n与底物和产物作用n改变酶蛋白的结构与柔韧性n改变酶促反应动力学特征6.4 6.4 酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性有机介质对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都有机介质对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性. .n底物特异性底物特异性n立体选择性立体选择性

10、n区域选择性区域选择性n键选择性键选择性n热稳定性热稳定性n活性活性npHpH值值6.4.2 6.4.2 立体选择性立体选择性 6.4.3 6.4.3 位置选择性位置选择性酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。位置特异性位置特异性：酶可以选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应就是位置特异性，也称区域选择性。6.4.4 6.4.4 化学键选择性化学键选择性化学键选择性是指当同一个底物分子中有化学键选择性是指当同一个底物分子中有2个以上的化学键个以上的化学键都可以与其进行反应时，酶对其中的一个化学键可以优先进都可以与其进行反应时，酶对其中

11、的一个化学键可以优先进行催化反应。行催化反应。介质的转换对酶的化学键选择性有不同程度的影响介质的转换对酶的化学键选择性有不同程度的影响n根据分子识别理论，酶通过配体的诱导、相互作用改变酶的构象，从而获得与配体类似物结合的能力，这种由配体诱导产生的酶的记忆的方法称为分子记忆（molecular memory）n酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。有机相生物印迹酶有机相生物印迹酶枯草杆菌蛋白酶溶液枯草杆菌蛋白酶溶液含含N-Ac-Tyr-NHN-Ac-Tyr-NH2 2 冻干冻干除去抑制剂除去抑制剂枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶枯草杆菌蛋白酶溶液枯草杆菌蛋白酶溶液不含不含N-Ac-Tyr-N

12、HN-Ac-Tyr-NH2 2 冻干冻干枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶在辛烷中催化酯化反应的速度比较：在辛烷中催化酯化反应的速度比较：反应（反应（1 1）中得到）中得到的酶比反应（的酶比反应（2 2）中得到的酶高）中得到的酶高100100倍倍在水溶液中其活性：在水溶液中其活性：相同相同掌握原理掌握原理（1）（2）酶蛋白抑制剂冻干除去抑制剂有机溶剂水溶液分子记忆n原理：n竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。n水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用,水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性

13、增强，原来形成的高活性构象不再保持。沉淀或冻干最适pH水或缓冲液有机溶剂pH决定酶的离子化状态影响酶的构象酶的活性和选择性可以保持酶的最佳电离状态， “记住”最适pH最适pH与水相中的最适pH相同。u有机相中酶能够记住记住最后保存其的水溶液的pH，称为“pH记忆”（pH memory）。n“pH记忆记忆”原因原因n（A）有机溶剂不会改变酶蛋白带电基团的离子化状态，（在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象)。所以酶在有机溶剂中的化学状态与从中提取该酶的水溶液中的化学状态保持相同；n（B）酶在有机溶剂中结构刚性的增加保持了之前水溶液中带电官能团正确的离子化状态，对酶的活性和稳定性都非常

14、重要。n实验现象：随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大，酶活会增大。6.6 6.6 酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用 手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性手性药物两种对手性药物两种对映体的药效差异映体的药效差异手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用NH2COOHHNCOOHPhacNH2COOHHNCOOHPhacDL-TlePhacCl10% NaOH+PGAN-Phac-(DL)-TleN-Ph

15、ac-(D)-TleL-TleShu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al., Bioprocess and Biosystems Engineering, 2006(In press).Shu-Lai Liu，Dongzhi Wei*, et al., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 2006(In press).青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分青霉素酰化酶催化叔亮氨酸拆分 利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。的合成与拆分。 乙酸异丙酯乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 RRSS+RCOOCH3