PCR原理与技术

1、PCR-polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，实际上是一种体外的DNA复制技术。因此，它的过程与体内DNA复制有相似之处，只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。体内DNA复制首先是将双链DNA打开，使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成，PCR是通过降温使人工合成的引物退火。延伸都是聚合酶发生作用的阶段，只不过体内体外的温度不同。PCR原理PCR过程：变性、退火、延伸，此过程循环反应。变性就是将双链的DNA打开，使其变成单链，以使引物可与其结合（碱基互补配对）。变性的方法就是升高温度到94-98

2、，温度因酶而异。退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度，进行聚合反应。以上3个过程完成一次为一个循环，一般PCR可以进行25-35次循环。扩增225-35倍。PCR原理从PCR的过程可知道，PCR反应的进行需要的条件为：DNA聚合酶模板引物原材料和能量dNTP反应发生所需要的水盐环境还有外部环境条件温度（PCR仪提供）PCR原理94 3min （预变性）94 30s （变性）60 30s （退火）72 1min （延伸）72 10min （充分延伸）4 hold （可有可无）PCR经典反应条件25-35个循环Taq酶 （有很多种聚合酶）Buffer （反

3、应所需要的缓冲液，含镁离子等）dNTP模板DNA （来自基因组DNA, 质粒，cDNA等）引物DNA （公司合成）无核酸酶的水PCR反应体系（1）模板）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100uL 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应体系参数（2）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 mmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ul 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量PCR

4、反应体系参数（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性PCR反应体系参数（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度PCR反应体系参数（1）变性）变性 使双链DNA解链为单链 94 20-30秒（2）退火）退火

5、温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数（3）延伸）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加循环参数PCR动画引物设计原则 引物设计必须具有特异性，应在没有同源序列的区域内设计 引物长度一般在1530碱基之间 G+C含量在40%60%之间 引物尽量不形成二级结构，引物之间尽量不形成二聚体 碱基要随机分布，引物自身不能有连续5个以上的相同碱基 引物5端可以修饰，引物3端必须严格互补 引物3端要避开密码子

6、的第3位，并且尽量不要用A 引物设计要跨内含子或隔内含子 注意mRNA 有不同的isoform，不同的引物可能针对不同的isoform进行扩增引物设计常用资源引物设计常用资源Primer Premier 5Oligo 6BeacondesignerPrimer Express Software（AB corporation）普通引物设计及分析网上real-time引物库Primer bank/primerbank/real-time 引物设计专用普通PCR反转录PCR（rt-PCR） 巢式PCR反向PCR不对称PCR实时PCR（real-tim

7、e PCR，RT-PCR）http:/ 鼠白血病病毒来源的M-MLV rt-PCR有一步法和两步法两种。rt-PCR18一步法：逆转录和特异性扩增在一管内完成，需用基因特异性引物两步法：先逆转录得到cDNA ，再分别进行扩增，需用Oligo dT 或随机引物 两者区别：一步法简单，减少污染的几率，可适用于大量样品和定量分析，但一次只能分析一个基因，cDNA 不能重复利用；两步法比较灵活，一次逆转录可以检测多个基因，方便进行比较，推荐使用两步法一步法和两步法一步法和两步法逆转录逆转录模板：提取的RNA底物：dNTP 引物：Oligo dT适用于真核生物的mRNA 逆转录，对RNA样品质量要求高，

8、甚至可以得到全长cDNA 。随机引物适用于长的、低丰度的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的逆转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况 。20总总 RNA 提取步骤（以细胞为例）提取步骤（以细胞为例）1、将细胞（六孔板、6cm培养皿）用冷PBS洗一遍，弃去PBS2 、向培养皿中加1ml Trizol，反复吹打，并转移至1.5ml RNAse free的EP管中，室温放置5min，使细胞完全裂解3 、加入200ul 氯仿，剧烈摇晃15s，12000rpm离心15min，44、转移上清500ul至

9、一个新的1.5ml RNAse free EP管中5、加入500ul 异丙醇异丙醇，充分混合，室温放置10min，12000rpm离心10min，4 6、弃去上清液，此时可见白色、弃去上清液，此时可见白色RNA沉淀沉淀7、加入、加入1ml 75%乙醇乙醇，轻轻洗沉淀，轻轻洗沉淀，12000rpm离心离心5min，4 8、小心弃去液体，开盖放置、小心弃去液体，开盖放置EP管，等待沉淀完全干管，等待沉淀完全干燥燥9、加入、加入30100ul RNAse free H2O，溶解，溶解RNA10 、将、将EP管放置管放置60 加热器中加热器中10min，助溶，助溶RNA11 、定量定量12、 -80

10、保存保存RNA质量的鉴定质量的鉴定分光光度法 ：OD260/2801.92.1 : RNA 纯度好小于1.8 ： 有蛋白或酚污染大于2.2 ： RNA降解用TE（Tris-HCl-EDTA) 洗脱，OD260/280会偏大 （2.02.3）琼脂糖电泳法 ：28S亮度约 为18S的两倍28S18SFrom internet24RNA提取的注意事项提取的注意事项I.新鲜组织、细胞新鲜组织、细胞II. 低温操作（如液氮研磨，冰上处理）低温操作（如液氮研磨，冰上处理）III. 低温保存（低温保存（-80），勿反复冻融），勿反复冻融IV. 所有仪器、试剂均要进行无所有仪器、试剂均要进行无RNAse处理，

11、处理，尤其是水尤其是水V. 操作人员戴帽子、口罩，勤换手套操作人员戴帽子、口罩，勤换手套VI. 使用使用RNAse 抑制剂抑制剂RT-PCRReal-time PCR，是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。使用仪器：荧光实时定量PCR仪，是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件普通PCR ：终点定量，结果不稳定，反应环境、循环次数对结果影响较大，不能定量起始DNA模板数量。Real-time PCR ： 灵敏度高（SYBR green 法）/特异性高

12、（分子信标、Taqman法），线性关系好，高通量，可定量起始DNA模板数量。普通PCR与real-time PCR的比较 内掺式染料SYBR Green I 序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)荧光定量PCR标记方法5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission 30Taqman 法法 ：以Taqman探针为基础，Taqman探针是两端分别标有荧光发射基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，探针完整时

13、，两基团靠近，不能检测到荧光信号，当特异性扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性使探针降解，两基团分开，此时可检测到荧光并实现荧光的积累。From AB corporation在普通引物设计的基础上，还要注意I.引物要短，1525为好II.引物内部不能有二级结构，引物之间不能形成二聚体III. 产物片段不能太长，以100250为好IV. Tm值在60 左右为好V.产物必须是单一的real-time PCR引物设计原则：引物设计原则：real-time PCR探针设计原则：探针设计原则：I.探针序列要保守，与靶DNA要完全互补，无非特异结合II.同时考虑在两条链上设计探针III. 探针位置尽可能靠近

14、上游引物IV. 长度通常2030bp，Tm 6570 ，GC含量4070%，C比G明显多V.探针5端避免使用G，以免淬灭探针Real-time PCR 检测实例检测实例（以SYBR green 法为例）SYBR green 法既可以绝对定量又可以相对定量绝对定量： 未知样本DNA拷贝数通过从已知量的标准品的标准曲线标准曲线中直接推算出相对定量： 不需知道样本DNA拷贝数，通过与同一样本中内参的比较得出样本DNA的相对丰度，用于样品之间比较Xn = X0 (1+Ex)n = M实际PCR扩增产物增加的数学模型：n: 循环数 X0 : 初始模板量EX :扩增效率 （ Ex = 0 1 )Xn :

15、n次循环后终产物的量 Real-time PCR 可用于定量检测的可用于定量检测的数学原理数学原理理想PCR扩增产物增加的数学模型：Xn = X0 2nPCR扩增效率小于 1 的原因I.反应体系有限反应体系有限II. 终产物增加对反应的抑制终产物增加对反应的抑制III. 酶活性下降酶活性下降IV. 酶酶-模板复合物饱和模板复合物饱和V. 引物消耗引物消耗VI. 离子浓度变化离子浓度变化XCt = X0 (1+Ex)Ct = M取对数log XCt = log X0 (1+Ex)Ct = log Mlog XCt = log X0+log(1+Ex)Ct = log Mlog X0 = -Ct

16、log (1+Ex) + log MCt : 反应产物的量达到阈值时的循环数反应产物的量达到阈值时的循环数 0log X0Ct Real-time PCR 可用于定量检测的可用于定量检测的数学原理数学原理36阈值阈值 ： real-time PCR中预先设定的荧光信号强度，当反应中荧光信号达到阈值后，收集到的信号才被认为是有效信号阈值阈值阈值阈值可由机器自动设置，也可手动设置，机器默认315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍作为阈值相对定量很多时候我们不需要知道样品的绝对量，只需要知道样品比对照组是增多（减少）多少倍，因此不需要做标准曲线，把样本直接和对照组来比较得出相对值。相对定量的方法：同

17、一样本要做内参的检测，内参常选用管家基因，如GAPDH。内参的特点是在所检测的所有样品中有恒定高量的表达。内参的高低可以反应样本量的多少。不论是绝对定量还是相对定量都需要做4个复孔。 由SYBR GREEN 染料的特点我们可以知道，PCR的产物必须单一，引物必须没有二聚体形成，否则PCR杂带和二聚体形成的双链也会被误收集而干扰结果。 所以，引物设计很关键。如何在软件上判断引物是不是良好，需要观察溶解曲线。好的溶解曲线是一条单一的峰。39在 AB 7300 real-time PCR仪上创建反应文件 From AB corporation40创建绝对定量反应板（相对定量也用这个程序）41选择荧光SYBR和参比荧光ROX42选择要进行反应的孔，单击SYBR前的复选框43给反应孔命名44切换到instrument选项卡，设置反应条件，反应体系反应体系并添加融解曲线45在File菜单中选Save As，保存反应板文件4