基因工程大肠杆菌表达系统

1、基因工程大肠杆菌表达系统最佳的基因表达体系：最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高目的基因的表达产量高;表达产物稳定表达产物稳定;生物活性高生物活性高;表达产物容易分离纯化。表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略第一节基因的表达系统与表达策略第1页/共61页宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求适合目的基因表达的宿主细胞的要求: : 1 1、容易获得较高浓度的细胞；、容易获得较高浓度的细胞； 2 2、能利用易得廉价原料；、能利用易得廉价原料； 3 3、不致病、不产生内毒素；、不致病、不产生内毒素； 4 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；、发热量低、需氧低、

2、适当的发酵温度和细胞形态； 5 5、容易进行代谢调控；、容易进行代谢调控； 6 6、容易进行、容易进行DNADNA重组技术操作；重组技术操作； 7 7、产物的产量、产率高，、产物的产量、产率高， 8 8、产物容易提取纯化。、产物容易提取纯化。第2页/共61页宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：1 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等；链霉菌等；2 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。物细胞等。第3页/共61页一、真核基因的大肠杆菌表达体系一、真核基因的大肠杆菌表达体系 目前，已

3、被用于表达外源蛋白质的表达系目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。肠杆菌表达系统具有明显的优越性。第4页/共61页大肠杆菌表达体系的优越性大肠杆菌表达体系的优越性： 1. 1. 对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序哦），特别是基因表达调控对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序哦），特别是基因表达调控的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解；的分子机理有（乳糖操纵子）深刻的了解； 2. 2. 是一种安全的基因工

4、程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；的载体； 3. 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。第5页/共61页大肠杆菌中表达体系的不足大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 1. 真核基因，在结构上同原核基因之真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。间存在着很大的差别。 2. 2. 真核基因的转录信号同

5、原核的不同。真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的细菌的RNARNA聚合酶不能识别真核的聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 3. 真核基因真核基因mRNAmRNA的分子结构同细菌的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因的有所差异，影响真核基因mRNAmRNA稳定稳定性。性。第6页/共61页4. 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在组装），而大多数的这

6、类修饰作用在细菌细胞中并不存在；细菌细胞中并不存在；5. 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。们降解掉。6. 6. 大肠杆菌周质内存在各种内毒素。大肠杆菌周质内存在各种内毒素。第7页/共61页克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件最基本条件：应该能够进行正常的转：应该能够进行正常的转录和转译，以及在正常情况下还与转录和转译，以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。有关。启动子启动子、终止子终止子以及正确以及正确读码

7、读码框（框（ORF）。 第8页/共61页重要条件重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。稳定性。具有核糖体结合位点；具有核糖体结合位点；具有强启动子；具有强启动子；第9页/共61页二、大肠杆菌的表达载体二、大肠杆菌的表达载体1、大肠杆菌表达载体的基本成分、大肠杆菌表达载体的基本成分TTGACA。TATAAT-3517-10PRTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBS第10页/共61页外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数转录

8、水平翻译水平第11页/共61页（1）启动子）启动子 要使克隆的外源基因高水平表达的最佳要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：启动子，必须具备以下几个条件：1）必须是一个强启动子。）必须是一个强启动子。2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。重要的条件。3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如（如热）和化学（如IPT

9、G）诱导）诱导 。第12页/共61页（2）转录终止子）转录终止子* 当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。子时，便会使该启动子的功能受到抑制。启动启动子封堵作用子封堵作用* 在克隆基因编码区的在克隆基因编码区的3-末端接上一个有效的转末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。录终止子，便能够阻止转录通读。 此外，转录终止子还能增强此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。第13页/共61页（3）翻译起始序列）翻译起始序列 mRNA转

10、录本转录本5端的独特的结构特征（核糖端的独特的结构特征（核糖体结合位点，体结合位点，RBS），是决定），是决定mRNA翻译效率翻译效率的主要因素。的主要因素。 至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在低在mRNA转录本转录本5-末端形成二级结构的实验方法，末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如例如: 在在RBS序列中增加序列中增加AT含量；含量；诱发特异碱基诱发特异碱基发生定点突变；发生定点突变；

11、以及使用翻译偶联系统进行克隆基以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。因的表达。第14页/共61页（4）翻译增强子）翻译增强子 大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子翻译增强子。 例如：例如：T7噬菌体基因噬菌体基因10的前导序列（的前导序列（g10-L）、）、以大肠杆菌以大肠杆菌atpE基因为代表的一些基因为代表的一些mRNA分子分子5-UTR中的富含中的富含U的区段，以及直接位于的区段

12、，以及直接位于T7基因起基因起始密码子下游的始密码子下游的“下游元件下游元件”等。等。分子机制不明。分子机制不明。第15页/共61页（5）翻译终止密码）翻译终止密码 对对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的子，以便阻止发生核糖体的“跳跃跳跃”现象。现象。 已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其，尤其是当连上一个是当连上一个U而形成而形成

13、UAAU四联核苷酸的情况下，四联核苷酸的情况下，翻译终止的效率进一步提高。翻译终止的效率进一步提高。第16页/共61页2、常用的大肠杆菌表达载体、常用的大肠杆菌表达载体 迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。表达载体系统。 最常用的：最常用的： 噬菌体的噬菌体的PL启动子，大肠杆启动子，大肠杆菌的菌的Lac启动子、启动子、Trp启动子，以及启动子，以及pBR322质粒的质粒的 -内酰胺酶启动子等一批强启动子构内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。成的。第17页/共6

14、1页三、大肠杆菌的转化方法三、大肠杆菌的转化方法1、Cohen转化法转化法1972年年Cohen改进而成，是目前最常用的方法。改进而成，是目前最常用的方法。操作步骤：操作步骤：（1）将处于对数生长期的新鲜培养物（）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于，于4, 4000转转/分钟离心分钟离心10分钟，回收细菌细胞；分钟，回收细菌细胞；（2）将细胞用）将细胞用0的的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生；以诱导细胞感受态产生；（3）加入适量的）加入适量的DNA后，于后，于42 热处理热处理90秒；秒；（4）将混合物快速转移到冰

15、浴中，是细胞冷却）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，分钟，加入适当的培养基在加入适当的培养基在37 培养培养45分钟，使细胞复苏，并表分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因；达质粒所携带的转化基因；（5）选择培养基培养，选择转化体。）选择培养基培养，选择转化体。第18页/共61页2、Hanahan转化法转化法 1983年由年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用的诱导方面，除了用CaCl2和和MnCl2等二价离子按一等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、

16、二硫苏糖醇（）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。 这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使转化效率提高转化效率提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。有效的转化。 值得注意的是：值得注意的是：此法要求的条件高，对外界污染此法要求的条件高，对外界污染物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极少数情况下才使用此法。少数情况下才使用此法。第19页/共61页3、电转化法

17、、电转化法第20页/共61页 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和时间和DNA浓度等参数的影响。浓度等参数的影响。 转化效率：转化效率：108-109转化体转化体/g DNA。 当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致50%-70%细菌死亡时，转化效率达到最高。细菌死亡时，转化效率达到最高。第21页/共61页 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用冷却的去离子水反复清洗，最

18、后用10%甘油重甘油重悬细胞，使其浓度为悬细胞，使其浓度为3 1010细胞细胞/毫升，在干冰毫升，在干冰或液氮中速冻后置于或液氮中速冻后置于-70 贮存。贮存。 转化必须在转化必须在0-4 下进行。下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。如果在室温下操作，转化效率会大大降低。第22页/共61页四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达1、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位* 克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位：克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位： 细胞质；细胞周质；分泌到细胞外细胞质；细胞周质；分

19、泌到细胞外 这三种表达部位各有不同的优缺点，而且对这三种表达部位各有不同的优缺点，而且对表达量和表达产物的制备有很大关系。表达量和表达产物的制备有很大关系。第23页/共61页在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点表达部位表达部位 优点优点 缺点缺点细胞质细胞质 1、 形成包涵体形成包涵体 1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性 （1）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 2、还原的环境不利于二硫键的形成、还原的环境不利于二硫键的形成 （2）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解）

20、蛋白质受保护而免受胞内酶的降解 （3）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害 2、表达的质粒载体构建比较简单、表达的质粒载体构建比较简单 周质周质 1、周质中蛋白质种类较少，纯化简单、周质中蛋白质种类较少，纯化简单 1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 2、蛋白质酶解程度不严重、蛋白质酶解程度不严重 2、有可能形成包涵体、有可能形成包涵体 3、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠 4、蛋白质、蛋白质N-末端结构真实末端结构真实胞外胞外 1、蛋白质的酶解作用程度很底、蛋白质的酶解作用程度很底 1、在大肠杆菌细

21、胞中表达的外源真核蛋白通、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通 2、目标蛋白的纯化容易，由于分泌到胞外的、目标蛋白的纯化容易，由于分泌到胞外的 常不会分泌到胞外常不会分泌到胞外 蛋白种类少蛋白种类少 2、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释，因、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释，因 3、增进了蛋白质的折叠作用、增进了蛋白质的折叠作用 此目标蛋白的得率较低此目标蛋白的得率较低 4、蛋白质、蛋白质N-末端结构真实末端结构真实第24页/共61页* Talmadge和和Gilbert（1982）将外源蛋白质在）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果：大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果： 细胞质中

22、表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了原的半衰期延长了10倍以上。（倍以上。（原因：细胞周质原因：细胞周质中蛋白酶的含量低中蛋白酶的含量低）到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。* 使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。第25页/共61页2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性、外源蛋白质在大肠杆菌

23、细胞中的稳定性 当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。着它的多肽产物是稳定的。影响因素包括：影响因素包括：第26页/共61页（1）蛋白质的降解作用）蛋白质的降解作用 在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，在大

24、肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。 已知有许多因素，如已知有许多因素，如不完全多肽不完全多肽、氨基酸取代突变氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤作用而造成的翻译后损伤，以及以及基因工程技术的效应基因工程技术的效应等，等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异

25、常蛋白质。质。第27页/共61页 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：了许多种不同的技术方案。主要有：1）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达；）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达；2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株；）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株；3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长；）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长；4）使目标基因以融合蛋白形式表达；）使目标基因以融合蛋白形式表达；5）置换多

26、肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点；）置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点；6）对目标蛋白质作疏水性修饰。）对目标蛋白质作疏水性修饰。第28页/共61页（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性）结构决定因子与蛋白质的稳定性 与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？ 不清楚不清楚 但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结构决定因子。构决定因子。 其中最重要的：其中最重要的：N-端氨基酸性质。端氨基酸性质。第29页/共61页N-端氨基酸性质端氨基酸性质 “N-端法则端法则”: 在生物体内蛋白质新陈代谢的在生物体内蛋白质新陈代谢的

27、稳定性，主要取决于稳定性，主要取决于N-端氨基酸的性质。端氨基酸的性质。 在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr 和和Trp等残基，则其稳定等残基，则其稳定性较差；而同样条件下，若性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述端为除了前述6种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时，种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时，其稳定性则大大提高。其稳定性则大大提高。 重组操作时，重组操作时， N-端增加一个增加稳定性的氨基酸端增加一个增加稳定性的氨基酸第30页/共61页（3）表达天然的蛋白质）表达天然的蛋白质 以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌

28、细胞中以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因具有许多方面的优越性。表达外源真核基因具有许多方面的优越性。例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶的降解作用，可以获得较高的产率。的降解作用，可以获得较高的产率。 Tacon等人在等人在80年代初期，使用大肠杆菌的年代初期，使用大肠杆菌的trp启动子和与之相连的启动子和与之相连的SD序列，构建了两种序列，构建了两种有利于表达天然蛋白质的质粒载体。有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551和和pWT571第31页/共61页（4）分子伴侣）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用稳定

29、作用分子伴侣：分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻指一类多功能蛋白质，它能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。的功能蛋白质的组成成分。 通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、实现高水平表达的有效方法。实现高水平表达的有效方法。第32页/共61页（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质

30、的稳定性 通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将天然蛋白质完整无损地切割下来。天然蛋白质完整无损地切割下来。 一种相当有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶一种相当有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细菌。其中用得最多的是质的寄主细菌。其中用得最多的是缺失缺失lon蛋白蛋白酶酶的大肠杆菌突变株。的大肠杆菌突

31、变株。第33页/共61页五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素 启动子的强度、启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子转录起始序列、密码子的选择、的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率。效率。第34页/共61页1、启动子对克隆基因表达效率的影响、启动子对克隆基因表达效率的影响(1) 启动子结构对表达效率的影响启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的序

32、列结构具有两个保守序大肠杆菌启动子的序列结构具有两个保守序列，即列，即-35区（区（5-TTGACA）和）和-10区（区（5-TATAAT），后者又叫），后者又叫Pribnow盒。盒。 应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强，两者呈正比关系。达能力也就越强，两者呈正比关系。第35页/共61页 此外，此外，两个保守序列之间的距离也影响两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于近于17个碱基个碱基，启动子的

33、活性就越强。，启动子的活性就越强。第36页/共61页（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响达效率的影响 Roberts等用等用 plac5.1 DNA的含有的含有lac启动子和启动子和SD序列与序列与 cro基因表达序列构建了不同间隔距离基因表达序列构建了不同间隔距离的重组质粒载体。从中挑选了的重组质粒载体。从中挑选了9种不同的重组质粒种不同的重组质粒载体，分别转化大肠杆菌细胞，然后测定各种克载体，分别转化大肠杆菌细胞，然后测定各种克隆所产生的隆所产生的cro蛋白质含量，同时也对每种质粒中蛋白质含量，同时也对每种质粒中的连接的连接lac-cro基因的结

34、合区序列进行测定。基因的结合区序列进行测定。第37页/共61页ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATGTGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATACBamHI从lac启动子开始转录Cro转译起始密码SDlacpTR213pTR199pTR214pTR188pTR194pTR210pTR182pTR1901.630.0851.000.650.510.850.0012

35、 0.0006* 图中示出图中示出 pTR161质粒的从质粒的从lac启动子到启动子到cro基因转译起点间的碱基序列。还基因转译起点间的碱基序列。还示出示出pTR161质粒的质粒的8种派生质粒的序列缺失程度。数字表示相对于种派生质粒的序列缺失程度。数字表示相对于pTR161的蛋的蛋白质合成数量。白质合成数量。结果表明：结果表明：携带不同重组体质粒的菌株所合成的携带不同重组体质粒的菌株所合成的cro蛋白质数量，是同蛋白质数量，是同lac-cro基基因的结合区序列相关联，但这种相关性并没有一定的规律；因的结合区序列相关联，但这种相关性并没有一定的规律；但但 5端与端与SD序列之序列之间的距离应间的

36、距离应 15bp。第38页/共61页（3）提高克隆基因表达效率的实验方案）提高克隆基因表达效率的实验方案BamHIEcoRIEcoRI酶切酶切BamHI具具EcoRI末端的克隆片段末端的克隆片段BamHIT4T4连接酶连接酶EcoRIEcoRIBamHI酶切酶切S1核酸酶消化核酸酶消化通过控制消化时间通过控制消化时间制造不同缺失大小制造不同缺失大小Lac启动子片段启动子片段克隆基因克隆基因T4连接酶连接酶EcoRIEcoRILac启动子片段启动子片段EcoRIEcoRIEcoRIEcoRI第39页/共61页2 2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率、质粒载体的生物学特性与基因表达效率（1 1）

37、质粒的拷贝数）质粒的拷贝数 由于细胞中的核糖体数量与任何一种由于细胞中的核糖体数量与任何一种mRNA分子数量相比，都是大大超量的。因分子数量相比，都是大大超量的。因此，增加此，增加mRNA分子数量是提高克隆基因表分子数量是提高克隆基因表达效率的有效途径。达效率的有效途径。 增加增加mRNA分子数量的因素有两种：分子数量的因素有两种：1）启动子强度；启动子强度；2）基因的拷贝数，即基因剂）基因的拷贝数，即基因剂量；最简易的方法是将基因克隆到高拷贝的量；最简易的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体上。质粒载体上。第40页/共61页 质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主

38、菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多数高拷贝数的质粒载体，都是由数高拷贝数的质粒载体，都是由ColE1衍衍生而来的。生而来的。 ColE1及其衍生质粒的复制，受两种及其衍生质粒的复制，受两种负调节成分的控制：负调节成分的控制：RNAI和和Rom蛋白质。蛋白质。第41页/共61页 RNAI是由是由ColE质粒质粒DNA编码的长度为编码的长度为108 nt的不翻译的不翻译RNA分子，它通过干扰分子，它通过干扰RNAII的加工来的加工来抑制质粒的复制。抑制质粒的复制。 Rom蛋白是由蛋白是由ColE质粒质粒rom基因编码的一种反基因编码的一种反式作用抑制剂，它可形

39、成二聚体增强式作用抑制剂，它可形成二聚体增强RNAI和和RNAII之间的碱基配对，从而抑制引物的形成。之间的碱基配对，从而抑制引物的形成。 因此，因此， rom基因的缺失或基因的缺失或RNAI基因的突变，基因的突变，都会引起质粒拷贝数的增加。都会引起质粒拷贝数的增加。第42页/共61页（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响 质粒分离的不稳定性是指质粒缺陷性分配引质粒分离的不稳定性是指质粒缺陷性分配引起的质粒丢失现象。起的质粒丢失现象。 天然质粒都可以稳定地保持在寄主细胞内，这天然质粒都可以稳定地保持在寄主细胞内，这是由于它们具有一段是由于它们具有一段分配功

40、能区分配功能区Par所致。分配所致。分配功能区功能区Par能够保证质粒分子在每次细胞周期中能够保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地分离，并均匀地分配到子细胞中去。都能准确地分离，并均匀地分配到子细胞中去。第43页/共61页 克服质粒丢失的方法：克服质粒丢失的方法：1）将）将Par克隆到表达载体；克隆到表达载体；2）对无质粒细胞进行反选择。）对无质粒细胞进行反选择。大体步骤为：使大体步骤为：使携带目的基因的质粒同时带上编码携带目的基因的质粒同时带上编码 启动子的启动子的 cl基因，形成特殊的重组质粒。然后用一种启动子基因，形成特殊的重组质粒。然后用一种启动子缺陷的缺陷的 突变体感染携带这种重组

41、体质粒的大肠突变体感染携带这种重组体质粒的大肠杆菌寄主细胞，使之成为溶源性细菌。在这种溶杆菌寄主细胞，使之成为溶源性细菌。在这种溶源性细菌中，重组质粒的丧失，伴随着发生源性细菌中，重组质粒的丧失，伴随着发生 阻阻遏物的丧失，则原噬菌体便被诱发进入溶菌生长遏物的丧失，则原噬菌体便被诱发进入溶菌生长周期，从而使寄主细胞裂解死亡。周期，从而使寄主细胞裂解死亡。第44页/共61页3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响转录本的分子特性对基因表达效率的影响（1）翻译起始系列对表达效率的影响）翻译起始系列对表达效率的影响 许多细菌基因起始密码子许多细菌基因起始密码子5上游都存在上游都存在510个核

42、苷个核苷酸的核糖体结合位点（酸的核糖体结合位点（RBS），特称为），特称为SD序列序列。它包。它包含含5-UAAGGAGG-3的全部或其中一部分。的全部或其中一部分。 已经鉴定出已经鉴定出SD序列与序列与16S rRNA分子之间的碱基互分子之间的碱基互补程度，可明显地影响补程度，可明显地影响mRNA的翻译速率。当此序列的翻译速率。当此序列为为5-GGAGG-3时，可与时，可与16S rRNA 3端区段完全互补，端区段完全互补，翻译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，翻译翻译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，翻译效率便下降效率便下降30倍之多。倍之多。第45页/共61页 连接在连接在SD序

43、列后面的序列后面的4个碱基成分的改变，会对个碱基成分的改变，会对翻译效率发生很大影响。翻译效率发生很大影响。如果这个区域是由如果这个区域是由4个个A或或4个个T碱基组成，其翻译最有效；而当是由碱基组成，其翻译最有效；而当是由4个个C或或4个个G碱基组成，翻译效率则只及最高翻译效率的碱基组成，翻译效率则只及最高翻译效率的50%或或25%。 直接位于起始密码直接位于起始密码AUG上游的三个碱基的三联上游的三个碱基的三联体组成，同样也对翻译效率发生影响。体组成，同样也对翻译效率发生影响。以以 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶mRNA的翻译为例，当这三联体组分为的翻译为例，当这三联体组分为UAU或或CUU时，翻

44、译效率最高；而如果是时，翻译效率最高；而如果是UUC、UCA或或AGG时，翻译水平下降时，翻译水平下降20倍。倍。第46页/共61页(2) mRNA的稳定性对表达效率的影响的稳定性对表达效率的影响 mRNA的的稳定性稳定性是指是指mRNA分子的相对寿命，或对分子的相对寿命，或对内源内源RNase降解作用的抵抗能力。降解作用的抵抗能力。 在细菌细胞中，有两类不同的核糖核酸酶参与在细菌细胞中，有两类不同的核糖核酸酶参与mRNA降解作用：核糖核酸内切酶（降解作用：核糖核酸内切酶（RNaseE、RNaseK和和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（）和核糖核酸外切酶（RNaseII和和PNPasepol

45、ynucleotide phosphorylase）。）。 在不同种类的细菌中，这些核糖核酸酶的含量比例不在不同种类的细菌中，这些核糖核酸酶的含量比例不同。例如，在大肠杆菌细胞中，同。例如，在大肠杆菌细胞中，90%的外切核酸酶是的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草杆菌细胞中，占绝对优势的外切核酸；而在枯草杆菌细胞中，占绝对优势的外切核酸酶是酶是PNPase第47页/共61页 为了维护自身的稳定性，为了维护自身的稳定性， mRNA 分子在进化过分子在进化过程中也形成了两种保护性结构元件：程中也形成了两种保护性结构元件：5-UTR系列系列和和3-UTR系列系列以及以及顺反子间区（顺反子间区（in

46、tercistronic region）的茎环结构）的茎环结构。 将大肠杆菌将大肠杆菌mRNA分子的某些保护性结构元分子的某些保护性结构元件与外源件与外源mRNA融合，便可起到稳定剂的作用。融合，便可起到稳定剂的作用。第48页/共61页4、遗传密码子的使用对基因表达效率的影响、遗传密码子的使用对基因表达效率的影响（1）密码子使用的偏爱性）密码子使用的偏爱性 遗传密码有简并性，即一种氨基酸有数个同遗传密码有简并性，即一种氨基酸有数个同义密码子；例如，亮氨酸共有义密码子；例如，亮氨酸共有6个密码子。个密码子。 无论真核基因还是原核基因，一种特定的氨基无论真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是

47、以同等频率使用所有的同义密码子，而酸并不是以同等频率使用所有的同义密码子，而主要使用其中的某一两种。这种遗传密码使用的主要使用其中的某一两种。这种遗传密码使用的非随机性现象非随机性现象密码子使用的偏爱性密码子使用的偏爱性。第49页/共61页造成密码子使用的偏爱性的两个原因：造成密码子使用的偏爱性的两个原因：1）细胞中同工）细胞中同工tRNA的丰度差异；的丰度差异；2）嘧啶碱基结尾的密码子（）嘧啶碱基结尾的密码子（C或或U）之间的非）之间的非随机选择。随机选择。实验发现，密码子第实验发现，密码子第3位结尾的嘧啶位结尾的嘧啶碱基在使用上是非随机的，存在着偏爱性，且碱基在使用上是非随机的，存在着偏爱

48、性，且这种偏爱性与基因的表现度有关。对于具高表这种偏爱性与基因的表现度有关。对于具高表达活性的基因，如果密码子的头两个碱基是达活性的基因，如果密码子的头两个碱基是AA或或UU，则其第三位碱基偏向选用，则其第三位碱基偏向选用C，而如果头，而如果头两个碱基是两个碱基是GG或或CC，则其第三个碱基偏向选，则其第三个碱基偏向选用用U。3） 碱基含量（碱基含量（AT/GC）第50页/共61页（2）密码子使用的偏爱性对基因表达效率的影响）密码子使用的偏爱性对基因表达效率的影响* 富含大肠杆菌罕见密码子的外源真核基因是很富含大肠杆菌罕见密码子的外源真核基因是很难在大肠杆菌细胞中得到有效的表达。反之，则难在大

49、肠杆菌细胞中得到有效的表达。反之，则表达效率提高。表达效率提高。 * 到底多少含量的罕见密码子才不会给克隆在大到底多少含量的罕见密码子才不会给克隆在大肠杆菌的外源基因的表达造成负面影响？肠杆菌的外源基因的表达造成负面影响？机制还不明确。机制还不明确。第51页/共61页5、寄主细胞的生理状态对基因表达的影响、寄主细胞的生理状态对基因表达的影响 大肠杆菌的生理状态会或多或少地影响外源基大肠杆菌的生理状态会或多或少地影响外源基因的表达效率；但究竟是怎样影响外源基因的表因的表达效率；但究竟是怎样影响外源基因的表达效率，仍缺乏全面系统的研究。达效率，仍缺乏全面系统的研究。 影响大肠杆菌生理状态的因素：包

50、括培养基影响大肠杆菌生理状态的因素：包括培养基营养成分、细胞培养方式、以及培养温度和培营养成分、细胞培养方式、以及培养温度和培养基中所溶解的氧等。养基中所溶解的氧等。第52页/共61页宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求适合目的基因表达的宿主细胞的要求: : 1 1、容易获得较高浓度的细胞；、容易获得较高浓度的细胞； 2 2、能利用易得廉价原料；、能利用易得廉价原料； 3 3、不致病、不产生内毒素；、不致病、不产生内毒素； 4 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5 5、容易进行代谢调控；、容易进行代谢调控； 6 6、容易进行、容易进行DNADNA重组技术操作；重组技术操作； 7 7、产物的产量、产率高，、产物的产量、产率高， 8 8、产物容易提取纯化。、产物容易提取纯化。第53页/共61页大肠杆菌中表达体系的不足大肠杆菌中表达体系的不足： 1. 1. 真核基因，在结构上同原核基因之真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。间存在着很大的差别。 2. 2. 真核基因