核酸分子杂交七年制学习教案

1、会计学1核酸核酸(h sun)分子杂交七年制分子杂交七年制第一页，共50页。第1页/共49页第二页，共50页。应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断疾病的诊断(zhndun)等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用用, 而且在临床基因诊断而且在临床基因诊断(zhndun)上的应用也日趋增多。上的应用也日趋增多。 检测检测(jin c)对象对象: 克隆化的基因组克隆化的基因组DNA,、细胞总、细胞

2、总DNA、总、总RNA。杂交方法不。杂交方法不同，被检测同，被检测(jin c)的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂即细胞原位杂交。交。核酸分子核酸分子(fnz)杂交特点：高度的灵敏性杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性、高度的特异性第2页/共49页第三页，共50页。第3页/共49页第四页，共50页。 基本原理：基本原理：DNADNA变性、复性与分子变性、复性与分子(fnz)(fnz)杂交杂交第4页/共49页第五页，共50页。第5页/共49页第六页，共50页。融解温度：融解温度：50杂化核酸杂化核酸分子解链温度称为寡核苷分子解链

3、温度称为寡核苷酸探针的酸探针的Tm值。值。寡核苷酸探针的长度、碱寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列基的含量和核酸的序列(xli)决定了探针的决定了探针的Tm值值。实际操作中，常选择低于实际操作中，常选择低于Tm值值5-10进行杂交。进行杂交。 Tm=4 X（G + C）+ 2 X（A + T）第6页/共49页第七页，共50页。 例如，一个长度为例如，一个长度为500bp的探针，（的探针，（G+C）含量为）含量为50%，杂交，杂交(zjio)体体系中含系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和）和50%甲酰胺，则其甲酰胺，则其Tm值为：值为： Tm=81.5 + (-2.07)

4、 + 20.5 1 30.5=68.4 50%甲酰胺溶液甲酰胺溶液, 温度一般选择低于温度一般选择低于 Tm值值20-25杂交杂交(zjio)温度应温度应:68.4 - 25 =43.2 甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的酸杂交的Tm值，值，50%的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使Tm降低降低30第7页/共49页第八页，共50页。53535353影响核酸分子杂交的因素影响核酸分子杂交的因素探针的浓度、长度、复杂性探针的浓度、长度、复杂性离子离子(lz)强度强度温度与变性剂（甲酰胺）温度与变性剂（甲酰胺）杂交条件的严

5、谨性杂交条件的严谨性 第8页/共49页第九页，共50页。常用的封闭物：常用的封闭物：（1）变性的非特异性）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精如鲑鱼精DNA、小牛胸腺、小牛胸腺DNA，又称为覆盖，又称为覆盖(fgi)DNA。（2）高分子化合物：）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脱脂奶、脱脂奶粉粉第9页/共49页第十页，共50页。基本实验基本实验(shyn)步骤：步骤：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridizatio

6、n第10页/共49页第十一页，共50页。 核酸探针的类型核酸探针的类型 核酸探针的标记核酸探针的标记(bioj)方法方法 核酸探针的检测核酸探针的检测 第11页/共49页第十二页，共50页。按化学按化学(huxu)本质分：本质分：DNA探针探针 RNA探针探针 按标记按标记(bioj)物分：放射性标记物分：放射性标记(bioj)探针探针核酸核酸(h sun)探探针的类型针的类型 3H、32P、35S、125I等等优点：高特异性，高灵敏度优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性标记探针非放射性标记探针生物素，地高辛、荧光素等生物素，地高辛、荧光

7、素等第12页/共49页第十三页，共50页。（2）酶促标记法：）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后(rnhu)利用酶学的方法将标记物掺入到探针分利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等切刻平移法、随机引物法、末端标记法等第13页/共49页第十四页，共50页。光敏生物素标记法光敏生物素标记法:强光强光10-20分钟，光敏基团分钟，光敏基团(j tun)与核酸探针的磷酸基与核酸探针的磷酸基团团(j tun)以共价键结合。以共价键结合。第14页/共49页第十五页，共50页。（2）酶促标记）酶促标记(bioj

8、)法：法： 将标记将标记(bioj)物预先标记物预先标记(bioj)在核苷酸分子上，然后利用酶学的在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记方法将标记(bioj)物掺入到探针分子上。物掺入到探针分子上。 缺口平移法、随机引物法、末端标记缺口平移法、随机引物法、末端标记(bioj)法等法等32P或或35S同位素标记同位素标记的单核苷酸的单核苷酸dig-dUTP的结构的结构(jigu)第15页/共49页第十六页，共50页。（1）缺口平移法）缺口平移法由由DNA酶酶和大肠和大肠(dchng)杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNA酶酶：在双链：在双链DNA上随机上随机(su j)打开打开

9、若若干个单链缺口，产干个单链缺口，产生生3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)DNA聚合聚合酶酶：53DNA聚聚合酶活性；合酶活性； 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（nicktranslation）“边切除、边聚合边切除、边聚合”第16页/共49页第十七页，共50页。最合适的缺口最合适的缺口(quku)平移片段一般为平移片段一般为50-500个核苷酸。个核苷酸。DNA酶酶的用量和的用量和E.coli DNA聚合酶聚合酶的质量会影响产物片段的大小。的质量会影响产物片段的大小。DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的故应

10、使用仔细纯化后的DNA。第17页/共49页第十八页，共50页。随机引物（随机引物（4-6nt）：含有各）：含有各种可能种可能(knng)排列顺序的排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段(pin dun)： 53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性 无无53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2）随机）随机(su j)引物法（引物法（random priming）第18页/共49页第十九页，共50页。产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有5 3外切酶活性外

11、切酶活性, 反应稳定反应稳定, 可以获得可以获得(hud)大量的有效探针大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。模板也可进行反应。第19页/共49页第二十页，共50页。（3）探针）探针(tn zhn)的末端标记：在的末端标记：在5或或3端通过酶促反应加上标记物端通过酶促反应加上标记物第20页/共49页第二十一页，共50页。核酸探针核酸探针(tn zhn)检测方法检测方法同位素标记探针同位素标记探针(tn zhn)：放射自显影检测杂交：放射自显影检测杂交信号信号 放射自显影是指利用放射线在放射自显影是指利用放射线

12、在x线片的成影作用来检测杂交信号。线片的成影作用来检测杂交信号。 取出杂交膜，在取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70曝光适当时间曝光适当时间(shjin)（1-7天天），在暗室中取出），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。线片上读出杂交带。第21页/共49页第二十二页，共50页。非放射性标记探针：偶联反应非放射性标记探针：偶联反应(fnyng)+显色显色反应反应(fnyng)Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应：

13、半抗原，可通过抗原抗体反应(fnyng)系统与显色体系偶联系统与显色体系偶联Dig-DNA探针探针 + 抗抗Dig抗体抗体(kngt)-碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（或辣根过氧化物酶（HRP） +底物底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色蓝紫色或或 DAB 红棕色；红棕色； TMB 蓝色蓝色第22页/共49页第二十三页，共50页。核酸分子核酸分子(fnz)杂交的杂交的分类分类第三节第三节 核酸分子杂交核酸分子杂交(zjio)技术技术第23页/共49页第二十四页，共50页。指将待测核酸序列指将待测核酸序列(xli)(xli)结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的结合到一定的支持物

14、上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。核酸探针进行杂交的过程。第24页/共49页第二十五页，共50页。特点：特点： 较强的结合核酸的能力（较强的结合核酸的能力（10g/cm2）; 与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应(fnyng); 与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等； 非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉; 具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。常用的

15、固相支持物：常用的固相支持物： 硝酸纤维膜（硝酸纤维膜（NC）、尼龙）、尼龙(nlng)膜、膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等膜（聚二氟乙烯膜）等第25页/共49页第二十六页，共50页。常用常用(chn(chn yn yn) )的固相支持物的固相支持物 硝酸纤维膜、尼龙膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDFPVDF膜等膜等第26页/共49页第二十七页，共50页。易破碎易破碎第27页/共49页第二十八页，共50页。第28页/共49页第二十九页，共50页。第29页/共49页第三十页，共50页。2印迹印迹(yn j)方法方法 Mechanics of transfer虹吸印迹虹吸印迹(yn j)法（法（Ca

16、pillary）真空转移法（真空转移法（Vacuum）电转移法（电转移法（Electrophoretic）Blot DNA to membrane第30页/共49页第三十一页，共50页。 1975年年 E. Southern Southern DNA 印迹印迹(yn j)转移技术转移技术DNA片段片段(pin dun)15kb，18小时小时第31页/共49页第三十二页，共50页。Electrophoretic blotting不宜不宜(by)用硝酸用硝酸纤维素膜纤维素膜一般一般(ybn)23小时，小时，最多最多6 8小时小时especially good for small fragments

17、 resolved by PAGE第32页/共49页第三十三页，共50页。3060分钟分钟more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too strongly第33页/共49页第三十四页，共50页。3印迹印迹(yn j)类型类型 Southern印迹杂交印迹杂交 Northern印迹杂交印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 反向反向(fn xin)斑点杂交斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交第34页/共49页第三十五页，共50页。提取提取(tq)DNA限制性内切酶消

18、化限制性内切酶消化(xiohu)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性(binxng)转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting hybridization 检测靶分子为检测靶分子为DNA, 检测靶分子是检测靶分子是否含有目的基因。否含有目的基因。 可用于可用于基因组基因的定性及定量分析、基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。基因突变分析等。预杂交预杂交第35页/共49页第三十六页，共50页。Paper TowelsSouthern Blotting

19、hybridizationtissueSDSProt KPhenolChloroSpin提取提取(tq)DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化(xiohu)琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳碱变性碱变性(binxng)、转移、转移到到NC膜膜与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影第36页/共49页第三十七页，共50页。第37页/共49页第三十八页，共50页。 检测靶分子为检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否检测靶分子是否(sh fu) 含有目的基因。含有目的基因。DNA指纹图谱指纹图谱Southern印迹杂交的应用印迹杂交的应用(yngyng)： 第38页/共49页第三十九页，共5

20、0页。Northern blotting hybridization检测检测(jin c)靶分子为靶分子为RNARNA极易被极易被RNase 降解降解(jin ji)RNA酶抑制剂酶抑制剂0.1%DEPC处理水处理水(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)第39页/共49页第四十页，共50页。与与Southern blotting hybridization不同之处：不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。不需要限制性核酸内切酶酶切。变性变性(binxng)方法不是碱变性方法不是碱变性(binxng)，而是采用聚乙二醛和二，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞

21、等方法。应用：应用：检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northern blotting hybridization第40页/共49页第四十一页，共50页。 pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNASouthern blotting hybridization第41页/共49页第四十二页，共50页。优点：简单、迅速（直接点样）；优点：简单、迅速（直接点样）；

22、可在同一张膜上进行多个样品的检测；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以可以(ky)得到半定量的结果；得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效果也较好。核酸粗提样品的检测效果也较好。Dot and slot blotting hybridization将变性将变性(binxng)后的后的DNA或或RNA直接点样与直接点样与膜上膜上第42页/共49页第四十三页，共50页。Reverse dot hybridization 直接将不同直接将不同(b tn)的探针点印并固定在膜上，再将待测的的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。是否含有这些探针的同源序列。DNA chip第43页/共49页第四十四页，共50页。第44页/共49页第四十五页，共50页。第45页/共49页第四十六页，共50页。 探针与分裂中期染色体探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究