AFP基因表达的检测----长沙小离

1、AFP基因表达检测基因表达检测RT-PCR (Reverse transcription PCR) 甲胎蛋白DNA序列mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 实验原理实验原理实验步骤实验步骤被被污染的试剂，缓冲液污染的试剂，缓冲液移液器移液器使用的器皿及使用的器皿及tip等等操作者的手，头发等操作者的手，头发等 RNA操作中应注意的问题：操作中应注意的问题： 防止防止RNase污染污染外源外源RNase的主要来源：的主要来源：RNA的提取的

2、提取1.1. 当处理当处理RNARNA时，移液器专用时，移液器专用2.2. 保证保证RNARNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；等留出专用；3.3. 溶液和试剂分装成小份保存；溶液和试剂分装成小份保存；4.4. RNARNA电泳装置专用（清洗、处理、电泳装置专用（清洗、处理、DEPCDEPC处理过的处理过的水冲洗）；水冲洗）；防止外源防止外源RNase污染的主要措施污染的主要措施5.5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNARNA酶的玻酶的玻璃器皿，璃器皿，DEPCDEPC处理过的水，用于处理过的水，用于RNAR

3、NA的化学药品的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用用0.10.1的的DEPCDEPC在在3737C C处理溶液处理溶液1 1小时后在小时后在15psi(1.05kg/cm15psi(1.05kg/cm2 2高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌15min15min。6.6. 180180300300C C烘烤玻璃器皿烘烤玻璃器皿4hrs4hrs以上或用其它灭活以上或用其它灭活RNARNA酶的商品化产品处理塑料制品；酶的商品化产品处理塑料制品；7.7. 使用新的、无使用新的、无RNARNA酶的一次性酶的一次性tubes, tipstubes, tip

4、s等；等；8.8. 在分离在分离RNARNA的过程中用的过程中用RNARNA酶抑制剂以抑制酶抑制剂以抑制RNARNA酶酶的活性。的活性。防止外源防止外源RNase污染的主要措施：污染的主要措施：材料要新鲜材料要新鲜; ;裂解过程要同裂解过程要同RNaseRNase活性抑制同步活性抑制同步防止内源防止内源RNARNA酶降解酶降解RNARNARNARNA酶抑制剂酶抑制剂RNA酶是一种强有力的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：1. DEPC(Diethyl-pyrocarbonate) 或DMDC(Dimethyl-dicarbo

5、nate)2. 氧钒核糖核苷复合物3. RNA酶的蛋白质抑制剂DEPC:是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物:能与多种能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制地抑制RNA酶的活性酶的活性RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。RNA提取提取RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和节和cDNA的合成都是必须的，的合成都是

6、必须的，RNA的纯度和完整性对的纯度和完整性对于于Northern blot, RT-PCR和和cDNA文库的构建等分子生文库的构建等分子生物学实验都至关重要。物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少的因素是尽量减少RNA酶的污染。酶的污染。 甲胎蛋白甲胎蛋白-作为作为原发性肝炎HCC肝肝癌微小转移标志物癌微小转移标志物实验目的：实验目的：学习学习RNA的简易制备过程，通过的简易制备过程，通过RNA电泳电泳带评价带评价RNA质量质量 实验材料：实验材料：水水HCC HCC 患者的外周血单核细胞（患者的外周血单核细胞（PMNCsPMNCs）AFP m

7、RNAAFP mRNA1. 外周血单个核细胞外周血单个核细胞( P MNCs) 的分离的分离 取受检者取受检者外周血外周血 5 ml , 肝素抗凝肝素抗凝 。采用密度梯度离心法。采用密度梯度离心法 , 用淋巴细胞分离液分离收集用淋巴细胞分离液分离收集 P MN Cs 。2. . P M NCs 的总的总 R NA 的提取的提取用用 Tr iz ol R N A 提取液提取液( GI BCO BRL ) , 以改良的异硫以改良的异硫氰酸胍氰酸胍 - 酚酚 - 氛仿一步法提取总氛仿一步法提取总 R AN , 放放 - 80 保存保存 。并抽提并抽提 Hep G2 细胞株的总细胞株的总 R N A

8、, 放放 - 80 保存保存 提取方法：提取方法：RNA降解的主要原因降解的主要原因取样后没有立即抽提取样后没有立即抽提RNA；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；样品运输、保藏不当，或样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入保藏不当，应放入-70 ，而不是，而不是-20 ）使用的溶液或器皿有使用的溶液或器皿有RNase污染污染琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于值低于3.5RNA污染的原因污染的原因 样品太多，所加试剂相对太少样品太多，所加试剂相对太少 用来分离用来分离RNA的样品中含有机溶剂的样品中含有机溶剂

9、（乙醇，（乙醇，DMSO等），或碱溶液等等），或碱溶液等RT-PCR (Reverse transcription PCR) 实验目的：实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程实验材料：实验材料：PMNCs的的mRNA 目前目前PCRPCR技术只能扩增技术只能扩增DNADNA模板，对模板，对RNARNA模板不能模板不能直接扩增。直接扩增。mRNA mRNA 反转录生成的反转录生成的cDNAcDNA可作为可作为PCRPCR的模板的模板进行扩增，这种在进行扩增，这种在mRNAmRNA反转录后进行的反转录后进行的PCRPCR扩增称为扩增称为RT-PCRRT-PCR。RT-PCRRT-PCR比比N

10、orthernNorthern杂交更灵敏，对杂交更灵敏，对RNARNA的质的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。时空表达的常用方法。 实验原理实验原理PCR技术技术PCR（多聚酶链式反应（多聚酶链式反应是一种体外扩增特异是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板之一，是在模板DNA、引物和、引物和dNTPs的存在下依赖的存在下依赖于于DNA聚合酶的酶促反应。聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应

11、分为于引物和模板结合的特异性。反应分为变性变性（denaturation，），）退火退火（annealing）、）、延伸延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异物之间的特异DNA片段得到大量扩增。片段得到大量扩增。 模板模板DNA：一般：一般102105个拷贝个拷贝 Mg2：Mg2能影响反应的特异性和扩增片段的产率。能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应反冲液反应反冲液 ：使：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏聚合酶的作用环境维持偏碱性。碱性。 dNTP：在：在PCR

12、反应体系中其浓度一般为反应体系中其浓度一般为 20200 mol/L，浓度过高、过低都不利。，浓度过高、过低都不利。 Taq DNA聚合酶：在聚合酶：在7075 C具最高活性。具有具最高活性。具有53的聚合酶活性和的聚合酶活性和53的外切酶活性，无校正功能。的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。是镁依赖性酶。 引物：引物：PCR反应中引物浓度一般为反应中引物浓度一般为0.10.5 mol/L。PCR反应体系中的主要成分及其作用：反应体系中的主要成分及其作用： 变性变性：模板：模板DNA由双链变成单链，使有利于与引物由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，结

13、合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下一般情况下94 C 30秒可使各种复杂的秒可使各种复杂的DNA分子完全分子完全变性变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合聚合酶活性和酶活性和dNTP分子造成损害）。分子造成损害）。 退火：变性的退火：变性的DNA快速冷却至快速冷却至4060 C可使引物和可使引物和模板模板DNA发生结合。可根据引物的长度和发生结合。可根据引物的长度和GC的含的含量选择复性温度。退火时间量选择复性温度。退火时间30秒。秒。 延伸：一般是延伸：一般是7075 C，此时，此时Taq DNA聚合酶活性聚合酶活性

14、最高。最高。1kb的可适当延长时间。的可适当延长时间。 循环次数：理论上循环次数：理论上2025个循环个循环PCR产物的累计即产物的累计即可达到最大值、实际操作中可达到最大值、实际操作中2530较合理。循环次较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加。数越多，非特异性产物的量也会增加。循环条件的设定：循环条件的设定：RT-PCR R T - PCR所用引物由中科院上海生物工程公司合成 , 引物序 列 如 下 : AF P 上 游 引 物 : 5 - T G CA GCCA AA GT GA AG A GG G - 3 ;AF P 下 游 引 物 : 5 - C AA GCT GCT TT

15、CT CTT A AT T C - 3 - a c tin 上 游 引 物 : 5 - T CT A C AAT GA GCT GC GT GT G G - 3 - a c ti n 下 游 引 物 , 5 G GA ACC GCT CAT T GCC AA T G - 3 。 - a c tin 作为内参照 。同时以 Hep G2 总 P N A 作为阳性对照 、 水作为阴性对照进行扩增 , 排除假阳性和假阴性的情况 。取 1 g 总 R NA 加入随机引物 0 . 5 g , 70 温浴 5分钟 ,迅速放置冰浴中 , 再加入 2 . 5 m M d NTP 4 l , R N A酶抑 制

16、剂 25u , 5 xR T 缓 冲 液 5 l , M M L V 逆 转 录 酶( Pr o me ga ) 200u , 加 D EP C 处理 水至总体积 25 l 。 37 温浴 1 小时 , 迅速放于冰中 , - 80 冰箱保存 。反转录反转录在 P CR 管中 分别加 入 : 去离子 水 10 l , 2 . 5 mMdN TP 4 l , A FP 上游引物 2 0 p mol , A FP 下引物 20 pmol , - ac ti n 上游引物 20 p mol , - a c ti n 下游引物 20 p mol , c D N A 7 l 。95 预变性 5 分钟 ,

17、迅速放于冰浴中 。变性变性再加入 10 x PCR 缓冲液 5 l , 25 m M Mg Cl2 溶液 3 l , Ta qD N A聚合酶 2u , 加去离子水至总体积 5 0 l 。 94 变性 30秒 , 59 . 5 退火 30 秒 , 72 延伸 40 秒 , 共进行 30 个循环 , 末次循环后 72 延伸 7 分钟 。PCR反应循环条件设置：反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA 的丰度等退火及延伸退火及延伸同时以 Hep G2 总 RN A 作为阳性对照 、 水作为阴性对照进行扩增 , 排除假阳性和假阴性的情况

18、 。阳性对照组：用倍比稀释法将不同数 量的 Hep G2 细胞加入到10 ml 正常人外周血中( 白细胞 107/ml) , 再提取 P MN Cs的总 R N A 并行 RT - PCR对照实验对照实验1.Taq酶过多；酶过多；2.Mg2+浓度不合适；浓度不合适；3.引物浓度过高或设计不合理；引物浓度过高或设计不合理；4.复性温度过低；复性温度过低；5.循环次数过多；循环次数过多；6.模板量过多；模板量过多；PCR产物的电泳检测时出现拖带或非产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：特异性扩增带的可能原因：PCR扩增产物电泳检测扩增产物电泳检测引物问题引物问题引物浓度过高：与模板错配，非特异扩增；