chapter细胞分离与破碎

1、1、过滤、过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器重力过滤器、压滤器、真空过滤器) 2、离心、离心 3、重力沉降、重力沉降 指固体颗粒在0.1m以上的固液分散体系。生物细胞培养液基本上也是悬浮液。水70-80% + 固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+ 少量的代谢成物 + 细胞破裂后的内容物 +残存的培养基成分A A、细胞成分及碎片大小不一，颗粒大小、细胞成分及碎片大小不一，颗粒大小 ，分离成，分离成本本 。B B、固液密度相近，黏度高：沉降和离心分离困难、固液密度相近，黏度高：沉降和离心分离困难C C、固体成分可压缩可变形、固体成分可压缩可变形 + + 高黏度：过滤困难，高黏度：过滤困难

2、，黏附在滤布，错流过滤形成凝胶层黏附在滤布，错流过滤形成凝胶层D D、动植物细胞抗剪切力差：错流膜过滤和离心等、动植物细胞抗剪切力差：错流膜过滤和离心等不适不适E E、流变性复杂，非牛顿型流体，青霉素发酵液为、流变性复杂，非牛顿型流体，青霉素发酵液为卡森型流体，卡森型流体，120h120h链霉素发酵液为拟塑性流体，链霉素发酵液为拟塑性流体，灰色链丝菌发酵液为塑性流体。灰色链丝菌发酵液为塑性流体。 预处理的目的预处理的目的: :改变发酵液的物理性质改变发酵液的物理性质(黏度、颗粒黏度、颗粒 、颗粒稳定、颗粒稳定性等性等)，固液分离速度，固液分离速度 ，分离器分离效率，分离器分离效率 ；目标产物转

3、移其中一相目标产物转移其中一相(多数为液相多数为液相)； 黏度、促凝聚、黏度、促凝聚、 固体成分体积、破坏凝胶结构、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白增加空隙率、去蛋白2、调、调pH值：方法简单有效、成本低廉值：方法简单有效、成本低廉pHpH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节适当调节pHpH可改善其过滤特性。对于氨基酸、蛋白可改善其过滤特性。对于氨基酸、蛋白质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调质等两性物质作为杂质存在于液体中时，常采用调pHpH至等电点使两性物质沉淀。另外，在膜分离中，至等电点使两性物质沉淀。另外

4、，在膜分离中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通过调发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，常通过调整整pHpH，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造，改变易吸附分子的电荷性质，以减少吸附造成的堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶成的堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个体物质等在某个pHpH下也可能趋于絮凝而成为较大颗下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于固液分离。粒，有利于固液分离。主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固主要作用为增大混合液中悬浮粒子的体积，提高固液分离速度，同时可除去一些杂质。液分离速度，同时可除去一些杂质。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝

5、聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm mm 大小块状凝聚体的过程。大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm10mm大小絮凝大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚：胶体粒子凝聚：胶体粒子(10-100nm)(10-100nm)中性盐促进下脱稳中性盐促

6、进下脱稳相互聚集成大粒子（相互聚集成大粒子（1mm1mm）机理：机理：a a 中和粒子表面电荷中和粒子表面电荷 b b 消除双电层结构消除双电层结构絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程形成絮凝团的过程机理：架桥作用机理：架桥作用 凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态和蛋白质等胶体粒子的分散状态, ,使其聚集起使其聚集起来来, ,增大体积以便固液分离增大体积以便固液分离, ,常用于菌体细小常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中而且黏度大的发酵液的预处理中. .发酵液中的

7、细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。附在其周围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，

8、在这两种相反动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核作用的影响下，双电层就分裂成两部分，在相距胶核表面约一个离子半径的表面约一个离子半径的sternstern平面以内，正离子被紧平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为密束缚在胶核表面，称为吸附层吸附层或或sternstern层；在层；在sternstern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为为扩散层扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。这

9、样就形成了扩散双电层的结构模型。凝聚剂种类凝聚剂种类：A、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、无机盐类，如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl2、硫酸镁等；、硫酸镁等；B、无机碱，如、无机碱，如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；等；C、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。、聚合无机盐，如聚合铝、聚合铁。 机理机理：A、破坏双电层，、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。、氢键结合等。絮凝剂种类絮凝剂种类：A、阳离子类，如聚丙烯酰胺、阳离子类，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚

10、二烯丙基四胺；烯丙基四胺；B、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺、阴离子类，如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-)；C、非离子类，如聚丙烯酰胺、非离子类，如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。、环氧化乙烯。机理机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。质的堵塞。 使用方法使用方法：A、预涂层；、预涂层；B、按一定比率混合。、按一定比率混合。 助滤

11、剂种类助滤剂种类：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。 用量标准用量标准：A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量量(最常用最常用)；B、或最长周期；、或最长周期；C、或最快流速；、或最快流速；D、或、或滤饼的最大空间利用度。滤饼的最大空间利用度。4、惰性助滤剂：、惰性助滤剂：0020040060061218pH4.6pH4.2pH3.8pH2.8FiltrateVolume,cm3Time,minutesFig2.1Theeffec

12、tonfiltratevolumeofpHandfilteraid图2.1pH值与助滤剂对过滤体积的影响(b)Effectoffilteraid1%filteraidinfeed2%3%5%Time,minutes0010040060061218FiltrateVolume,cm3Fig2.1TheeffectonfiltratevolumeofpHandfilteraid图2.1pH值与助滤剂对过滤体积的影响（续）有时加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4 、AlPO4等。生成的沉淀

13、能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。5 5加入反应剂加入反应剂在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成磷酸钙沉淀可充当助滤剂，另一方面可使某些蛋白质凝固。环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其它阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。发酵液的相对纯化发酵液的相对纯化 1. 无机离子的去除无机离子的去除 Ca2+、Mg2+、Fe2+等Ca2+离子浓度较高时，可采用可溶性盐，如草酸钠等Mg2+离子的去除一般采用加入三聚磷酸钠磷酸盐处理，也能

14、大大降低Ca2+、Mg2+离子的浓度铁离子，可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。2 2杂蛋白的去除杂蛋白的去除酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵完成后，发酵液中多余的淀粉使混合液粘度较大，当加入0.025的淀粉酶后，搅拌30min，再加2.5助滤剂（硅藻土），可使过滤速率提高5倍。 3 3多糖的去除多糖的

15、去除发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。例如活性炭可用于柠檬酸发酵液的脱色，盐型强碱性阴离子交换树脂可用于解朊酶和果胶酶溶液的脱色，磷酸型阴离子交换树脂被用于谷氨酸发酵液的脱色等。一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。 4 4有色物质的去除有色物质的去除Fdd=2R球形颗粒沉降的受力情况球形颗粒沉降的受力情况根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降根据沉降粒子间

16、相互影响程度可分为：自由沉降和干扰沉降根据沉降粒子间相互影响程度可分为：自由沉降和干扰沉降4.1 重力沉降重力沉降（Gravitational sedimentation） （1）球形颗粒的自由沉降速度）球形颗粒的自由沉降速度 以重力的方向为正方向以重力的方向为正方向 Fb 浮力浮力 Fd 阻力阻力 Fg 重力重力maFFFF bdg阻阻力力浮浮力力）（重重力力什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？重力沉降重力沉降（Gravitational sedimentation） 直径为直径为d、颗粒密度为、颗粒密度为s的球形颗粒在密度为流体中的重的球形颗粒在密度

17、为流体中的重力和浮力分别为：力和浮力分别为：gdFs3g6 重力：重力：（N）gdF 3b6 浮力：浮力：（N） t uu0加速段加速段匀速段匀速段 颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为自由自由沉降速度沉降速度。达到恒定的沉降速度时，合力为：。达到恒定的沉降速度时，合力为： 042662203s3 madugdgdF 42220dduF 阻力：阻力：（N）阻力系数阻力系数042662203s3 madugdgdF 34s0gdu （球形颗粒的自由沉降速度）（球形颗粒的自由沉降速度）（2）阻力（曳力）系数（）阻力（曳力）系数（Drag coef

18、ficient） 与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗粒与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗粒沉降雷诺数有关，即沉降雷诺数有关，即)(Re0f 00Redu 注意：注意：其中其中d为颗粒直径，为颗粒直径，u0为颗粒的沉降速度，为颗粒的沉降速度，、分别分别为流体的密度与粘度。为流体的密度与粘度。 通过实验得到曳力系数与雷诺数的关系绘成算图通过实验得到曳力系数与雷诺数的关系绘成算图,将他们将他们回归成关联式为：回归成关联式为：过渡区（过渡区（Allen区，区， 2 Re0 500）6 . 00Re5 .18 6 . 000Re269. 0 sgdu湍流区（牛顿区，湍流区（牛顿区

19、， 500 Re0 200000后，后，骤然下降，在骤然下降，在Re0 =(310)105范围内范围内可近似取可近似取= 0.1。层流区（层流区（Stokes区，区，Re0 2或或0.3）0Re24 18s20gdu （Stokes定律）定律）以上的沉降过程为在重力作用下以上的沉降过程为在重力作用下球形球形颗粒的颗粒的自由沉自由沉降降： 颗粒为球形；颗粒为球形； 颗粒沉降时彼此相距较远，互不干扰；颗粒沉降时彼此相距较远，互不干扰； 容器壁对沉降的阻滞作用可以忽略；容器壁对沉降的阻滞作用可以忽略； 颗粒直径不能小到受流体分子运动的影响。颗粒直径不能小到受流体分子运动的影响。 在实际情况中还需考虑

20、以下因素的影响：在实际情况中还需考虑以下因素的影响： 干扰沉降；干扰沉降； 端效应；端效应； 分子运动；分子运动； 非球形；非球形； 液滴或气泡的运动液滴或气泡的运动 。 注意：注意：离心沉降与重力沉降的类比。颗粒离心沉降的速离心沉降与重力沉降的类比。颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径向上的分量。向上的分

21、量。 r1r2ArCBuruut颗粒在旋转流体中的运动颗粒在旋转流体中的运动代入上式代入上式（2.15）沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient, S = Svedbergs = 10-13 s)：S计算：计算：颗粒在颗粒在20 C 水中的水中的Sw,20为为v 为溶质为溶质(颗粒颗粒)的单位质量的体积的单位质量的体积, w,20和和 L,T分别为分别为20 C 的水和的水和T C 溶剂的黏度溶剂的黏度， w,20和和 L,T 分别为分别为20 C 的水和的水和T C 溶剂的密度。溶剂的密度。 Sw,20与溶质（颗粒）浓度有关：与溶质（颗粒）浓度有关： 为为c0时的

22、沉降系数时的沉降系数(20 C 的水的水), k为常数为常数通过对通过对 积分积分可以得到溶质完全沉降所需的时间可以得到溶质完全沉降所需的时间1） 差速离心分级2）区带离心 （密度梯度离心） 差速区带离心 平衡区带离心 2.1.2.3 2.1.2.3 离心分离设备离心分离设备按分离因子按分离因子Fr分类分类 1)、常速离心机Fr 8000-15000g 4)、超速离心机，Fr = 20,000 1,000,000g用途分类用途分类 1)、分析性：超速离心机 2)、制备性：A、实验室用；B、工业用工业应用分类工业应用分类 1)、管式离心机 2)、多室离心机（管式离心机的变形） 3)、碟式离心机：

23、、人工排渣式, 、喷嘴排渣式, 、活塞排渣式 4)、螺旋卸料沉降离心机 5)、离心过滤 6)、三足式离心机2.1.2.3 2.1.2.3 离心分离设备离心分离设备Tubular bowl（2.21）离心机的放大可采用等校正系数法：概念概念 过滤是在外力作用过滤是在外力作用下下，利用过滤介质使悬浮液中的液体，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。种单元操作。过滤介质过滤介质具有多孔结构，可以截留固体物质，具有多孔结构，可以截留固体物质，而让液体通过；我们把待过滤的悬浮液成为而让液体通过；我们把待过滤的悬浮液成为滤浆（滤浆（Slurry），而过滤后分离出的固体称为，而过滤后分离出的固体称为滤渣滤渣或或滤饼（滤饼（Filter cake），通过过滤介质的液体称为通过过滤介质的液体称为滤液（滤液（Filtrate）。 （1）过滤介质（过滤介质（Filter medium）：）： 过滤介质应具有以下特性：多孔性，足够的机械强度，过滤介质应具有以下特性：多孔性，足够的机械强