第5章荧光光谱

1、第第5章章 荧光光谱荧光光谱5.1 基本原理基本原理5.2 荧光探测荧光探测5.3 荧光光谱法的应用荧光光谱法的应用F 荧光属于光致发光荧光属于光致发光 F 包括吸收和发射两个过程包括吸收和发射两个过程F 荧光光谱属于发射光谱荧光光谱属于发射光谱F 光致发光可以在紫外光致发光可以在紫外-可见光区、可见光区、X射线区等射线区等F 我们将关注紫外我们将关注紫外-可见光区，常用于有机化可见光区，常用于有机化合物分析合物分析5.1.1 荧光发光原理荧光发光原理光致发光的能级向下跃迁过程光致发光的能级向下跃迁过程无辐射跃迁无辐射跃迁：激发态第一电子激发态的最低能级在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到

2、第一电子激发态的最低能级荧光发射荧光发射：第一电子激发态的最低能级基态能级由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释放能量，即荧光磷光发射磷光发射：三重态基态能级先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级，发射磷光荧光与磷光的区别荧光与磷光的区别 从激发态跃迁到基态的路径不同 从激发到发光的时间不同，荧光10-910-7s 磷光10-310s (三重态是亚稳态) 发光波长不同，荧光波长比磷光波长短5.1.2 荧光光谱与吸收光谱荧光光谱与吸收光谱形状波长谱带数荧光光谱与吸收光谱的比较荧光光谱与吸收光谱的比较 荧光光谱灵敏度高，检测限可达ppb量级（10-9） 荧光光谱选择性好，能

3、吸收光的物质不一定能发射荧光，一定波长下不同物质的荧光光谱不同 荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光，并且荧光对环境因素非常敏感5.1.3 产生荧光的基本条件产生荧光的基本条件 入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态振动能级 物质粒子要具有高的荧光效率iiAFkkknnFF荧光过程速率常数，由物质粒子本身决定物质分子结构与荧光效率物质分子结构与荧光效率 具有大共轭双键的分子容易发射荧光，*跃迁的量子效率高，寿命短（10-910-7 s） 共轭效应越大，荧光效率越高，苯 萘 联苯 0.18芴联苯 取代基也会影响荧光效率 给电子基(

4、-NH2, OH)会增强荧光效率（共轭作用） 吸电子基(-NO2, -C=O, -C=NH)会减弱甚至猝灭荧光 取代基的空间阻碍作用会减弱荧光5.1.4 影响荧光光谱的因素（外部）影响荧光光谱的因素（外部） 入射光强，荧光强度与入射光强成正比 溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用 增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加 温度，升高温度 物质粒子碰撞增多 减弱荧光 pH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大 内滤光内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光 自吸收自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收吸收光谱与荧光强度（激发的选择？）吸收

5、光谱与荧光强度（激发的选择？）波长波长强度强度吸收光谱吸收光谱波长波长强度强度荧光光谱荧光光谱 吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃迁产生的荧光越强5.2.1 荧光探测装置荧光探测装置吸收光谱吸收光谱荧光光谱荧光光谱两点区别：1. 在入射光的垂直方向探测2. 探测器前还有一个单色器F-4500荧光光度计光路图（日立）荧光光度计光路图（日立）5.2.2 荧光团荧光团 许多物质不会发射荧光或荧光效率低 需要利用强荧光发射的荧光团（或荧光探针分子） 荧光探针分子需满足两个条件： (1) 能与待测物质某个微区专一而牢固的结合 (2) 这种结合不会破坏物质分子的结构和空间构象一些典型的荧光

6、团一些典型的荧光团色氨酸 348 nm4,6-二脒基-2-苯基吲哚461 nm 增强型绿色荧光蛋白509 nm四甲基罗丹明 576 nm染料 667 nm 染料染料cy3的吸收、发射光谱的吸收、发射光谱最大激发波长 550 nm最大发射波长 570 nm (黄绿光)绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP） GFP荧光是生物细胞的自主功能，GFP是一种广泛应用的活体报告蛋白5.2.3 荧光探测方法荧光探测方法 同步荧光光谱技术 (1) 在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图 (2) 两种同步扫描形式固定波长和固定能量固定波长和固定能量 (3)

7、固定波长：激发波长与发射波长间隔固定 (4) 固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定 (5) 特点特点： 与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善 能够增强强带而减小弱带的干扰 它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低，但同时会把拉曼吸收峰拉宽 (6) 波长间隔的选择非常重要！利用同步荧光光谱分离色氨酸利用同步荧光光谱分离色氨酸1、酪氨酸、酪氨酸2和苯丙氨酸和苯丙氨酸3的重叠荧光峰的重叠荧光峰一般荧光光谱同步荧光光谱(波长差70nm) 时间分辨荧光光谱技术 (1) 时间分辨荧光技术用于测量荧光发光过程（很短的衰减过程） (2) 用短脉冲信号激发荧光，取样积分探测

8、随时间变化的荧光强度 (3) 时间分辨荧光技术可以对发射光谱重叠但寿命有差异的组分进行测定，也可以测量荧光衰减曲线及寿命 相位分辨荧光光谱技术 (1) 也可以用于测量荧光寿命 (2) 基本原理：用正弦（或余弦）方式调制激发光光强，这样发射光强也会被正弦（或余弦）调制，由于吸收和发射之间的时间延迟，所以发射光的调制信号相比于激发光存在相位延迟，测量该相位延迟就可以得到荧光寿命 (3) 相分辨荧光技术是一种稳态测量技术，相比于时间分辨荧光技术，其灵敏度更高。5.3.1 元素分析（无机离子）元素分析（无机离子） 能发射荧光的无机离子很少，一般不能直接测量 无机离子的荧光分析法：直接法、荧光猝灭法、催

9、化荧光法 直接法直接法：无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物，直接测量络合物发射的荧光强度，很多元素可用该法，过渡金属离子除外 荧光猝灭法荧光猝灭法：无机离子本身不能形成荧光络合物，但可从金属-有机荧光试剂络合物中夺取金属或有机试剂，形成更稳定的络合物，使金属-有机荧光试剂络合物的荧光强度降低 ，比如：S, Fe, Co, Ag, Ni 催化荧光法催化荧光法：某些无机离子形成荧光络合物的速度很慢或荧光微弱而难于测定，但在微量金属离子催化下可使反应迅速进行，这时可由给定时间内测定的荧光强度来测量该金属离子浓度常用有机荧光试剂常用有机荧光试剂待测离子待测离子荧光试剂荧光试剂吸收波长吸收波长荧

10、光发射波长荧光发射波长Al3+，Fe-茜素紫酱R470 nm500 nmB4O22-苯偶姻370 nm450 nmSn4+黄烷醇400 nm470 nmLi+8-羟基喹啉370 nm580 nm5.3.2 有机物分析有机物分析 脂肪族有机化合物脂肪族有机化合物 具有高度共轭体系的或脂环化合物能发射荧光，维生素A、萝卜素 结构简单的脂肪族化合物本身能发射荧光的不多，需与有机试剂形成荧光化合物，可参考讲义中“荧光分析法测定丙三醇”的例子 芳香族化合物芳香族化合物 具有共轭不饱和体系结构，易于吸光，其中分子庞大而结构复杂的化合物在紫外光辐射下能产生荧光 荧光较弱的芳香族化合物可与有机试剂反应获得荧光

11、较强的物质 蛋白质：蛋白质：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe） 荧光强弱：Trp Tyr Phe 激发和发射波长：Trp Tyr Phe 色氨酸和酪氨酸的荧光最大发射波长分别为348和302 nm 荧光峰存在重叠，可利用同步荧光光谱分离，60 nm的同步荧光光谱为色氨酸的特征5.3.3 定量分析定量分析 定量分析基础定量分析基础AFIIbcAII100bcFII100bcIIF0303. 2荧光与吸收光强：朗伯-比尔定律：稀溶液近似 分析方法可借用紫外分析方法可借用紫外-可见光谱法中的直接比较法、标准曲可见光谱法中的直接比较法、标准曲线法、差示法等线法、差示法等课堂练习课堂练习1氧气在760 nm附近的吸收截面约为10-27 cm2，假设在一个光程为1 m的气体容器中充入