第三章 细胞生物学研究方法

1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜一、光学显微镜 几种显微镜观察样品的大小几种显微镜观察样品的大小: :（一）普通复式光学（一）普通复式光学 显微镜显微镜 光学放大系统光学放大系统 照明系统照明系统 镜架及样品调节系镜架及样品调节系统统（一）普通复式光学（一）普通复式光学 显微镜显微镜分辨率：分辨率： ：光波长；：光波长；N N：介质空气：介质空气=1=1； ：物镜镜口角：物镜镜口角（二）相差显微镜（二）相差显微镜 通过在普通光通过在普通光学显微镜上增加学显微镜上增加“环状光阑环状光阑”和物和物镜后焦面上的

2、镜后焦面上的“相相差板差板”来调节来调节/ /改变改变相位差，通过光的相位差，通过光的干涉作用转换成振干涉作用转换成振幅差，改变光亮。幅差，改变光亮。（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜构造：构造： 滤光片系统：滤光片系统： 激发滤光片激发滤光片 阻断滤光片阻断滤光片 专用物镜镜头专用物镜镜头（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜 激发滤光片：只激发滤光片：只许特定波长光通过许特定波长光通过 阻断滤光片：只阻断滤光片：只许可见荧光通过。许可见荧光通过。 （四）激光扫描共焦（四）激光扫描共焦显微镜（显微镜（LSCMLSCM） 共焦：共焦：指聚光镜与指聚光镜与物镜同时聚焦到样物镜同时聚焦到样品的同一点上。该

3、品的同一点上。该点以外发出的荧光点以外发出的荧光被共焦板挡住。被共焦板挡住。二、电子显微镜二、电子显微镜（一）电镜的基本知识（一）电镜的基本知识 1.1.光镜与电镜的基本区别光镜与电镜的基本区别（一）电镜的基本知识（一）电镜的基本知识 2.2.电镜的基本构造电镜的基本构造 电子束照明系统：电子束照明系统： 电子枪与聚光镜电子枪与聚光镜 成像系统：物镜、成像系统：物镜、 中间镜与投影镜中间镜与投影镜 真空系统：真空系统： 记录系统：记录系统：（二）主要电镜制片技术（二）主要电镜制片技术1.1.超薄切片技术超薄切片技术 切片厚度切片厚度40-50nm40-50nm固定：固定： 化学法化学法戊二醛、

4、四氧化饿（饿酸）戊二醛、四氧化饿（饿酸） 物理法物理法超低温冷冻超低温冷冻（二）主要电镜制片技术（二）主要电镜制片技术1.1.超薄切片技术超薄切片技术 切片厚度切片厚度40-50nm40-50nm 固定：固定： 包埋：包埋：用环氧树脂。包埋前样品要脱水用环氧树脂。包埋前样品要脱水 切片：切片：玻璃刀（常用）或石英刀玻璃刀（常用）或石英刀 染色：染色：金属盐染色。电子束在通过样品金属盐染色。电子束在通过样品 时，金属离子不同程度地散射或时，金属离子不同程度地散射或 吸收电子，在样品上形成明暗差别。吸收电子，在样品上形成明暗差别。（二）主要电镜制片技术（二）主要电镜制片技术 超薄切片样本制备过程超

5、薄切片样本制备过程2.2.冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术过程：过程： 冰冻断裂冰冻断裂 蚀刻复型蚀刻复型用途：用途：主要用来观察主要用来观察 膜断裂面上的膜断裂面上的 蛋白质颗粒和蛋白质颗粒和 膜表面形貌特膜表面形貌特 征。征。2.2.冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术过程：冰冻断裂过程：冰冻断裂 蚀刻复型蚀刻复型用途：主要用来观察用途：主要用来观察 膜断裂面上的膜断裂面上的 蛋白质颗粒和蛋白质颗粒和 膜表面形貌特膜表面形貌特 征。征。第二节第二节 细胞及其组分的分析方法细胞及其组分的分析方法一、超离心技术分离细胞组分一、超离心技术分离细胞组分 制备匀浆制备匀浆: :采用低渗匀浆、超声波粉碎或研采用低渗匀浆、

6、超声波粉碎或研磨的方法可使细胞膜破损，形成细胞核、磨的方法可使细胞膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体等细胞器和细胞组分的混线粒体、叶绿体等细胞器和细胞组分的混合物匀浆。合物匀浆。 差速离心差速离心: :使各种细胞组分和颗粒都分离开。使各种细胞组分和颗粒都分离开。更细的组分分离可采用梯度密度离心。更细的组分分离可采用梯度密度离心。差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心二、细胞成分的细胞化学显示方法二、细胞成分的细胞化学显示方法 显色剂与细胞内物质上特定基团特异显色剂与细胞内物质上特定基团特异性结合产生特异性颜色来分析该物质在细性结合产生特异性颜色来分析该物质在细胞的分布与数量。胞的分布与数量。

7、如：如： DNADNA上脱氧核糖的醛基与希夫试剂反应上脱氧核糖的醛基与希夫试剂反应生成紫红色以显示生成紫红色以显示DNADNA； 饿酸与细胞质内不饱和脂肪酸反应呈现饿酸与细胞质内不饱和脂肪酸反应呈现黑色；黑色； 氮汞试剂与蛋白质侧链上的酪氨酸残基氮汞试剂与蛋白质侧链上的酪氨酸残基反红色沉淀反红色沉淀。三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内蛋白质分子定位技术：细胞内蛋白质分子定位技术： 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫电镜技术免疫电镜技术三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术 亦称亦称荧光抗体技术荧光抗体技术。将免疫学

8、方法（抗。将免疫学方法（抗原原- -抗体特异结合）与荧光标记技术相结合抗体特异结合）与荧光标记技术相结合来研究特异蛋白质在细胞内的分布。来研究特异蛋白质在细胞内的分布。 荧光色素荧光色素( (如异硫氰酸荧光黄，如异硫氰酸荧光黄，FITC) )与与抗体抗体结合起来，即结合起来，即荧光抗体荧光抗体，再让荧光抗，再让荧光抗体与其对应的胞内抗原结合使之呈现荧光。体与其对应的胞内抗原结合使之呈现荧光。三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术 直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术1.1.直接免疫荧光技术实验步骤直接免疫荧光

9、技术实验步骤（1 1）荧光抗体制备）荧光抗体制备 将将10mg/ml10mg/ml的抗体溶液的抗体溶液10ml10ml装入透析袋，装入透析袋，将透析袋放入含将透析袋放入含0.1mg/ml FITC0.1mg/ml FITC的的pH9.4pH9.4的的碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液100ml100ml的烧杯中，的烧杯中，44磁力搅磁力搅拌拌24h24h，取出透析袋，进行纯化、鉴定。，取出透析袋，进行纯化、鉴定。 （2 2）标本处理）标本处理 滴加滴加0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS于待检标本于待检标本片上，片上，10min10min后弃去，使标本保持一定湿度。

10、后弃去，使标本保持一定湿度。 滴加适当荧光标记抗体稀释液，完全覆盖滴加适当荧光标记抗体稀释液，完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内保温标本，置于有盖搪瓷盒内保温30min30min左右。左右。 取出玻片用取出玻片用0.01mol/L0.01mol/L，pH7.4pH7.4的的PBSPBS冲洗冲洗后，再用后，再用PBSPBS振荡浸泡三次（振荡浸泡三次（3-5 min/3-5 min/次）。次）。 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。（3 3）镜检）镜检 标本处理后，立即用荧光显微镜观察。

11、标本处理后，立即用荧光显微镜观察。特异性荧光强度一般可用特异性荧光强度一般可用“+”+”表示：表示：（- -）无荧光；（）无荧光；（）极弱的可疑荧光；）极弱的可疑荧光；（+ +）荧光较弱，但清楚可见；（）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明）荧光明亮；（亮；（+ -+ -+）荧光闪亮。）荧光闪亮。 待检标本特异性荧光染色强度达待检标本特异性荧光染色强度达“+”+”以上，而各种对照显示为（以上，而各种对照显示为（）或（）或（- -），），即可判定为阳性。即可判定为阳性。2.间接免疫荧光技术实验步骤间接免疫荧光技术实验步骤、同同直接法直接法取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使取出玻片，用滤纸吸去多余

12、水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。记的抗人球蛋白抗体。将玻片在搪瓷盒内再于将玻片在搪瓷盒内再于37保温保温30min。重复操作重复操作。同同直接法直接法镜检，结果判定同接法。镜检，结果判定同接法。（二）免疫电镜技术（二）免疫电镜技术 免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术免疫酶标技术 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 实验步骤类似免疫荧光技术：实验步骤类似免疫荧光技术：标本标本固定、包埋、切片、免疫标记、染色固定、包埋、切片、免疫标记、染色等等免疫胶体金电镜技术的基本原理与应用免疫胶体金电镜技术的基本原理与应用示膀胱上皮细胞

13、膜蛋白示膀胱上皮细胞膜蛋白四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交技术原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体或在细胞中的位特异核苷酸序列在染色体或在细胞中的位置的方法称为置的方法称为原位杂交。原位杂交。原位杂交技术显原位杂交技术显示示Z13Z13基因在受精基因在受精后后1 1天的斑马鱼胚天的斑马鱼胚胎的体节、眼和胎的体节、眼和松果体中的表达松果体中的表达五、定量细胞化学分析五、定量细胞化学分析 与细胞分选技术与细胞分选技术 流式细胞仪流式细胞仪第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程一、细胞培

14、养一、细胞培养 原代培养原代培养 动物细胞培养动物细胞培养 传代培养传代培养 植物细胞培养植物细胞培养（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养 定义：定义： 动物细胞与组织培养是从动物体内取出动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。能的一门技术。 动物细胞培养是动物细胞工程的基础动物细胞培养是动物细胞工程的基础（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养 特征：特征： 1. 1. 倍增

15、时间长，生长缓慢倍增时间长，生长缓慢 2. 2.培养中需氧量少，对搅拌敏感培养中需氧量少，对搅拌敏感 3. 3.多以聚集体存在（多以聚集体存在（贴壁生长贴壁生长） 4.4.原代细胞培养原代细胞培养5050代即开始退化代即开始退化 5. 5.培养基要求有动物体液（如培养基要求有动物体液（如小牛血清小牛血清）（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养 操作步骤：操作步骤： 1. 1. 剪切：剪切：组织剪成组织剪成 2-3mm2-3mm3 3碎块碎块 、HanksHanks液清洗、青链霉素杀菌液清洗、青链霉素杀菌30-60min30-60min 2.2.消化：消化：用用30-5030-50倍组织体积的倍组

16、织体积的0.25%0.25%胰胰蛋白酶溶液于蛋白酶溶液于3737C C水浴消化水浴消化 3.3.镜检镜检：rpm500-1000rpm500-1000、5min5min；检查细胞；检查细胞单层单层覆盖瓶底覆盖瓶底4.4.培养：培养：向无菌合成向无菌合成培养基上接种消化后的培养基上接种消化后的 单层细胞，于单层细胞，于3737C C温箱或温箱或CO2CO2培养培养 箱（瓶塞用透气无菌棉塞）中培养。箱（瓶塞用透气无菌棉塞）中培养。5.5.监控：监控：1-21-2天后（细胞形态、培养液天后（细胞形态、培养液PHPH值）值） （正常呈桃红色，（正常呈桃红色，PH7.2-7.4PH7.2-7.4；若发；

17、若发 黄，说明偏酸，更换培养液）黄，说明偏酸，更换培养液）（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 植物组织培养植物组织培养 植物器官、组织、细胞或原生质体植物器官、组织、细胞或原生质体 等外植体材料无菌条件下培养在人工培等外植体材料无菌条件下培养在人工培 养基上，在适当条件下诱发长成完整植养基上，在适当条件下诱发长成完整植 株的一种技术。株的一种技术。 植物细胞培养：植物细胞培养： 单倍体细胞培养单倍体细胞培养 原生质体培养原生质体培养离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞 (外植体外植体)愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再

18、分化植物组织植物组织/ /细胞培养的基本过程细胞培养的基本过程（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养植物组织植物组织/ /细胞培养的基本操作程序细胞培养的基本操作程序培养材料（全能细胞）采集培养材料（全能细胞）采集 受精卵、分生组织细胞、配子和单倍受精卵、分生组织细胞、配子和单倍体细胞体细胞培养材料（组织块）的消毒培养材料（组织块）的消毒 材料洗净、沥干、切成小块材料洗净、沥干、切成小块 70%70%酒精酒精或或-10-10H H2 2O O2 2浸泡浸泡30-60s30-60s（无菌）（无菌） 消毒消毒10min10min（饱和漂白粉液或（饱和漂白粉液或0.01%HgCl0.01%HgCl2

19、2） 无菌水冲洗干净无菌水冲洗干净(3-4(3-4次次) )制备外植体制备外植体 将消毒材料按培养要求进行处理将消毒材料按培养要求进行处理 如：切成如：切成0.2-0.5cm0.2-0.5cm厚的小块厚的小块( (片片););去去除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮胚乳等。但除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮胚乳等。但叶片不需剥皮叶片不需剥皮接种与培养接种与培养接种：接种：外植体植入培养基上（外植体植入培养基上（4-104-10个个/ /瓶）瓶）封口：封口：培养瓶、管等用无菌材料密封培养瓶、管等用无菌材料密封愈伤组织培养：愈伤组织培养：外植体膨大形成愈伤组织外植体膨大形成愈伤组织增殖：增殖：继代培养与分化培

20、养。继代培养与分化培养。2525C C左右培养左右培养出新梢，分株或切段后于增殖培养基上继续出新梢，分株或切段后于增殖培养基上继续培养成芽苗培养成芽苗（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 （二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 1.1.机械法：机械法： 2.2.酶解法：纤维素酶、琼脂酶、果胶酶酶解法：纤维素酶、琼脂酶、果胶酶 3.3.愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织分愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织分散成单个细胞散成单个细胞 植物单细胞制备植物单细胞制备（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 1.1.分离：分离：机械法（质壁分离）；机械法（质壁分离）； 酶解法酶解法 2.2.纯化：纯化：离心沉

21、降法；离心沉降法； 漂浮法；漂浮法； 离心和漂浮结合法离心和漂浮结合法植物细胞原生质体制备植物细胞原生质体制备（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养 1.1.平板培养法平板培养法: :类似于微生物的平板培养类似于微生物的平板培养 2.2.看护培养看护培养: :常用愈伤组织看护常用愈伤组织看护 3. 3.饲养层培养饲养层培养: :无分裂能力的组织共培养无分裂能力的组织共培养 4. 4.液体浅层静置培养液体浅层静置培养: : 5. 5.细胞悬浮培养细胞悬浮培养: :植物单细胞培养方法植物单细胞培养方法二、细胞工程二、细胞工程 植物细胞工程植物细胞工程 细胞重组细胞重组 动物细胞工程动物细胞工程 细胞

22、融合细胞融合 胚胎工程胚胎工程 动物克隆动物克隆 染色体工程染色体工程 转基因动物转基因动物（一）植物细胞工（一）植物细胞工程程（一）植物细胞工程（一）植物细胞工程 细胞杂交：细胞杂交：（一）植物细胞工程（一）植物细胞工程 人工种子人工种子 种子的结构种子的结构种皮种皮胚乳胚乳胚胚什么是人工种子？什么是人工种子？就是将组织培养产生的体就是将组织培养产生的体细胞胚或不定芽细胞胚或不定芽包裹在能提供包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜具有保护功能和防止机械损伤的外膜，造成一种类似于种子的结构。造成一种类似于种子的结构。（一）植

23、物细胞工程（一）植物细胞工程胚胚 状状 体体人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳人工种子的制备人工种子的制备 包埋液（人工包埋液（人工胚乳）制备：胚乳）制备： 2%-3%2%-3%的海藻酸的海藻酸钠钠+ +营养物、生长因营养物、生长因子等子等。（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程1.1.细胞重组细胞重组 又称又称细胞拆合细胞拆合。是指从活细胞中分离。是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种

24、实验技术。细胞或细胞器的一种实验技术。（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程1.1.细胞重组细胞重组 （1 1）核体）核体 胞质分离得到的细胞核带有少量胞质胞质分离得到的细胞核带有少量胞质并围有质膜，称为核体。并围有质膜，称为核体。 （2 2）胞质体）胞质体 除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 2.2.细胞融合细胞融合 又称又称体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridiazation），），是指两个或更多个相同或不同细胞是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜通过膜 融合形成单个细胞的过程。融合形成单个细胞的过程。（二）

25、动物细胞工程（二）动物细胞工程 细胞融合过程：细胞融合过程： （二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 利用细胞融合、培养利用细胞融合、培养生产单隆抗体生产单隆抗体 应用举例应用举例（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 3.3.胚胎工程胚胎工程 是对哺乳动物的胚胎进行操作是对哺乳动物的胚胎进行操作, ,让它继让它继续发育获得人们所需要的成体动物的一种续发育获得人们所需要的成体动物的一种技术技术. . 包括包括胚胎培养胚胎培养、胚胎移植胚胎移植、胚胎分割与胚胎分割与融合融合、胚胎性别鉴定胚胎性别鉴定、胚胎保存胚胎保存等。等。（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 试管动物（婴儿）：试管动物（婴儿）：

26、体外受精通常是在试管中完成。由此体外受精通常是在试管中完成。由此体外受精后发育的胚胎再移植到供体动物体外受精后发育的胚胎再移植到供体动物体内发育生长而得到动物后代称体内发育生长而得到动物后代称试管动物试管动物。 精子的采集与获能；精子的采集与获能； 卵子的回收及成熟培养；卵子的回收及成熟培养； 体外受精；体外受精； 受精卵的体外发育；受精卵的体外发育； 试管胚胎的移植，等试管胚胎的移植，等试管动物的培育试管动物的培育（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 胚胎分割胚胎分割（embryo splitting） 即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分

27、胚，经体内或体外成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到培养，然后移植入受体中，以得到同卵双同卵双生生或或同卵多生同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。的一种方法。（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程胚胎融合胚胎融合 胚胎嵌合胚胎嵌合鼠女鼠女豹妹豹妹（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 4.4.动物克隆动物克隆细胞核移植细胞核移植 利用显微技术将一种动物细胞核移入利用显微技术将一种动物细胞核移入到同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的到同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。可能创造无性杂交新品种。技术。可能创造无性杂交新品种。（二）动物细胞

28、工程（二）动物细胞工程 4.4.动物克隆动物克隆细胞核移植细胞核移植 胚胚 胎胎 克克 隆：隆：使用的核供体细胞来自多使用的核供体细胞来自多 细胞阶段的胚胎。细胞阶段的胚胎。 体细胞克隆：体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动使用的核供体细胞来自动 物体。物体。细胞核移植是广义上的克隆：细胞核移植是广义上的克隆：胚胎细胞克隆动物胚胎细胞克隆动物体细胞克隆动物体细胞克隆动物（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 5.5.转基因技术转基因技术 通过人工方式将外源基因整合到生物通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该基因生物能稳定地将体基因组内，并使该基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。此基因遗传给后代的技术。 转基因动物转基因动物 转基因植物转基因植物（二）动物细胞工程（二）动物细胞工程 5.5.转基因技术转基因技术 转基因动物：转基因动物： 将特定的将特定的目的基因目的基因从某一生物体分离出从某一生物体分离出来，进行来，进行扩增和加工扩增和