考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量doc

1、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法（Bradford法）法）测定蛋白质含量测定蛋白质含量【实验目的】【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法。测定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和熟练分光光度计的使用和操作方法。操作方法。 【实验原理】【实验原理】 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。染料结合法的一种。 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，质通过范德华键结合成复合

2、物时变为蓝色，其最大吸收峰移至其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数，而且消光系数更大。更大。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250在游离状态在游离状态下呈红色，最大光吸收在下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质后变为青色，蛋白质-色素结色素结合物在合物在595nm波长下有最大波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G250的的结合十分迅速，约结合十分迅速，约2min即可即可反应完全，其复合物在反应完全，其复合物在1h内内保持稳定。保持稳定。考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250

3、与蛋白与蛋白质反应虽然比较缓慢，质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条所以可以用来对电泳条带染色。带染色。 在一定蛋白质浓度范围内在一定蛋白质浓度范围内 (11000g/ml）,蛋白质染料复合物在蛋白质染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 由于蛋白质染料复合物具有很由于蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为质测定的灵敏度（最低检出量为1g）。）。【器材与试剂】【器材与试剂】（一）器

4、材（一）器材 1. 可见光分光光度计可见光分光光度计 2. 刻度移液管刻度移液管 3. 移液枪移液枪 （二）试剂（二）试剂 1. NaCl （0.15mol/L） 2. 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂 3. 蛋白质标准液蛋白质标准液 （1mg /mL） 4. 待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液 1.如黑板上表格操作如黑板上表格操作2.绘制标准曲线：以绘制标准曲线：以A595nm为纵坐为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。标纸上绘制标准曲线。3.算出待测蛋白质浓度？算出待测蛋白质浓度？ 定义定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸分光光度法是利用物质所特有的

5、吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。极少量物质。 应用应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。量检测。 分光光度计的分类分光光度计的分类红外分光光度计红外分光光度计:可见光分光光度计可见光分光光度计:紫外分光光度计紫外分光光度计:测定波长范围为测定波长

6、范围为大于大于760 nm的的红外光区红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400 760 nm的的可见光区可见光区测定波长范围为测定波长范围为200400 nm的的紫外光区紫外光区可见光谱可见光谱可见光范围内波长和颜色的关系可见光范围内波长和颜色的关系分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括：光源、单无论哪一类分光光度计都包括：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示度计各部件的次序如图所示: 入射光入射光强度强度 Io透射光透射光强度强度 I样品池样品池 检测器检测器及仪表及仪表单色器单色器光源

7、光源光照射到物质上，物质的分子结构决定光照射到物质上，物质的分子结构决定哪些特定波长的光被吸收。这一现象符哪些特定波长的光被吸收。这一现象符合符合朗伯比耳定律。合符合朗伯比耳定律。入射光强度入射光强度 Io样品浓度样品浓度c光程光程 b透射光强度透射光强度 I当一束平行单色光当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液分被吸收，一部分透过溶液(I)朗伯朗伯比尔定律比尔定律: A=lg(1/T)=Kbc A为吸光度为吸光度;T为透光度为透光度,是透射光强度比上入射光强度（是透射光强度比上入射光强度（I/I0);c为吸光物质的浓度为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度为吸收层厚度(光程）光程）. 物理意义物理意义当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,