高效液相色谱法 (续)

1、11 高效液相色谱法 (续) 11.4 11.4 检测器检测器 最常用的液相色谱检测器依次是紫外最常用的液相色谱检测器依次是紫外检测器、示差折射检测器、荧光检测器检测器、示差折射检测器、荧光检测器和电化学检测器等。近年来出现的光散和电化学检测器等。近年来出现的光散射检测器是新兴的通用型检测器。射检测器是新兴的通用型检测器。 表11. 液相色谱常用检测器的一般性质 检测器检测器选择性选择性梯度洗脱梯度洗脱线性范围线性范围检测限检测限(g/ml)敏感性敏感性 对流速对流速对温度对温度紫外紫外紫外吸收紫外吸收可以可以10521010不敏感不敏感低低示差示差通用型通用型不可以不可以1042107不敏感

2、不敏感104荧光荧光荧光物质荧光物质可以可以1031011不敏感不敏感低低电化学电化学电活性电活性不可以不可以1061012敏感敏感1.5%电导电导离子离子不可以不可以2104108敏感敏感2%紫外紫外- -可见光吸收检测器可见光吸收检测器和和光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外紫外- -可见吸收检测器是一种应用最广可见吸收检测器是一种应用最广HPLCHPLC检测器：检测器： 光吸收定律光吸收定律 检测池结构检测池结构 波长选择波长选择：待测物的吸收波长和溶：待测物的吸收波长和溶剂的截止波长剂的截止波长光电二极管阵列光谱检测器 倒光学结构和多通道阵列检测倒光学结构和多通道阵列检测 时

3、间时间波长波长吸光度三维谱图吸光度三维谱图 大量数据采集、贮存和计算的计算机技术多波长检测多波长检测三维色谱图三维色谱图At二极管阵列检测器色谱图二极管阵列检测器色谱图常规色谱图三维色谱图光谱图 光电二极管阵列光谱检测器是光电二极管阵列光谱检测器是HPLCHPLC检测技术的重大进展。检测技术的重大进展。采用这种检测器可以采用这种检测器可以瞬间实时对流出液进行全光谱检测瞬间实时对流出液进行全光谱检测, , 使使LCLC能提供的信息量大幅度增加。换句话说能提供的信息量大幅度增加。换句话说, , 在一次色谱操作在一次色谱操作中中, , 可同时获得吸光值、流出时间和各组分的紫外可同时获得吸光值、流出时

4、间和各组分的紫外- -可见光谱可见光谱图在一起的三维谱图图在一起的三维谱图, , 提供既定量又定性的色谱信号。提供既定量又定性的色谱信号。 性能内容1A()固定测定波长色谱图（常规）（常规）2A1() A2()固定测定双波长色谱图33-Dim三维空间的光谱色谱图4Spectrum光谱的贮存和记录5S1 / S2光谱比较6Edit贮存光谱数据表11.6 光电二极管阵列检测器的应用 荧光检测器和化学发光检测器 荧光检测器是一种高灵敏的, 选择性检测器, 其灵敏度比UV 高10-1000倍, 一般可测ppb级的化合物。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测

5、的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等。 1荧光检测器的结构*激光诱导荧光检测器(Laser inducted fluorescence detector, LIF) 2 2色谱衍生技术色谱衍生技术色谱衍生技术色谱衍生技术：在色谱过程中用特殊的化学试剂（衍生试剂），借助于化学反应给样品化合物接上某个特殊基团，使其转变成响应的衍生物之后进行分离检测和直接进行检测的技术。OHRCOOROHRRCOOH2O)COCF(23 样品衍生的目的样品衍生的目的/ /作用作用1）改善色谱分离性能改善色谱分离性能，扩大应用范围。 如GC中增加样品的挥发

6、度和稳定性：例 1，3，5-三甲基苯甲酸与1，3，5-三甲基酚的酯化反应：2 2）提高检测的灵敏度和特异性。）提高检测的灵敏度和特异性。如有些化合物既没有紫外吸收又不发荧光, 这类样品可以用衍生的方法, 将待测物转变为具有紫外吸收或发荧光的物质进行检测。例如邻苯二甲醛(OPA)是最通用的伯胺氨基酸衍生剂, 柱前柱后衍生均可，ODS柱分离。l 紫外检测：UV的测定灵敏度可达1012 mol / Ll 荧光检测：检测范围在 1012 1015 mol / Ll 安培检测：灵敏度可达1013 mol / L 衍生方式衍生方式1）柱前衍生：分离与检测2）柱后衍生：检测，如氨基酸仪分析HH3CCOHOO

7、HCl+H3CHOCOOOC 由于2-甲基丁基-1，4-二醇不仅缺乏必要的吸收基团，而且不能在OB柱拆分，应采用苯甲酰氯将其衍生为2-甲基丁基-1，4-二醇二苯甲酸酯后才能进行分离测定。 所有合成产物均经柱层析纯化和结构分析。 图 2-甲基丁基-1，4-二醇二苯甲酸酯色谱拆分图色谱柱： ChiralcelChiralcel OB OB 流动相：正己烷-异丙醇(93:7) 检测： 254nm/275nm 流速：0.75mL/min(S)-(-)(R)-(+)OOOOOOn 三苯甲酸酯纤维素固定相蒸发光散射质量检测器蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mas

8、s Detector, ELSD) HPLC的发展中受到限制的一个原因, 就是缺少象GC中的FID一样的灵敏、通用型的检测器。20世纪80年代后研制的蒸发散射质量检测器给这一领域带来希望，并向具有真正通用型意义的检测器方向发展。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。 1 1） 工作原理工作原理 在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为 I = k mI = k mb b式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决

9、定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。 散射质量检测和电导测定一样，电导是所有离子的通用性质，光散射是所有粒子的通用性质。对于色谱法来说，溶质已经分离，关键的问题是如何除去流动关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性相和保证检测条件的一致性。雾化蒸发检测流动相雾化气体雾化器雾化器漂移管漂移管Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of dropletsStep 2: Mobile Phase Ev

10、aporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remainStep 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light ELSDELSD的工作原理的工作原

11、理：经色谱柱分离的组分随流动相进：经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器，被高速的载气流（氦气和空气）喷成一种入雾化器，被高速的载气流（氦气和空气）喷成一种薄雾。这些雾粒进入可控制温度的蒸发器（漂移管）薄雾。这些雾粒进入可控制温度的蒸发器（漂移管）中，使流动相气化蒸发，溶剂蒸发后剩下的不挥发组中，使流动相气化蒸发，溶剂蒸发后剩下的不挥发组分成为微小的雾状颗粒，进入光散射室进行检测。光分成为微小的雾状颗粒，进入光散射室进行检测。光源光线经准直后成直角方向通过气流，然后被光阱捕源光线经准直后成直角方向通过气流，然后被光阱捕集，以防止反射。蒸气状态溶剂通过光路时，光线反集，以防止反射。蒸气状态溶剂通过

12、光路时，光线反射到检测器上成为稳定的基线信号。云雾状溶质颗粒射到检测器上成为稳定的基线信号。云雾状溶质颗粒通过光路时，被位于入射光束通过光路时，被位于入射光束1201200 0角的检测器收集。角的检测器收集。 检测器参数：检测器参数：l l 雾化载气流流速：雾化载气流流速：2 5 L / minl l 蒸发器温度：蒸发器温度：100 180 2） 蒸发散射质量检测器的优缺点蒸发散射质量检测器的优缺点 与示差折光检测器相比与示差折光检测器相比： l l灵敏度高灵敏度高 l l对流动相系统温度变化不敏感对流动相系统温度变化不敏感 l l可进行梯度洗脱可进行梯度洗脱 与光吸收检测器相比：与光吸收检测

13、器相比：l l能解决最困难的能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测收系数很小的化合物的检测l l减低流动相溶剂的纯度要求减低流动相溶剂的纯度要求l l无需测定定量校正因子无需测定定量校正因子高效液相色谱的主要分离方法 根据溶质的不同保留机理或色谱分离过程的物理化学原理，液相色谱的分离模式可分为 ： 吸附色谱吸附色谱 (Adsorption Chromatography) 分配色谱分配色谱（Partition Chromatography） 离子交换色谱离子交换色谱

14、（Ion Exchanger Chromatogr.） 空间排阻色谱空间排阻色谱（Size Exclusion Chromatogr.） 亲合色谱亲合色谱（Affinity Chromatography）吸附色谱Flow流动相活性吸附点固定相液固吸附色谱用固体吸附剂作固定用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各作流动相，样品中各组分依据它们在吸附组分依据它们在吸附剂上吸附力的大小来剂上吸附力的大小来进行分离的色谱方法。进行分离的色谱方法。 分配色谱液液分配色谱用涂渍在基体上的固定用涂渍在基体上的固定液作固定相，以不同极液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品性溶

15、剂作流动相，样品中各组分依据它们在固中各组分依据它们在固定液中溶解能力大小，定液中溶解能力大小，即在固定相和流动相间即在固定相和流动相间的分配系数大小来进行的分配系数大小来进行分离的色谱方法。分离的色谱方法。离子交换色谱离子交换色谱用离子交换剂作固定相，用离子交换剂作固定相，以具有一定以具有一定pH值的缓值的缓冲溶液作流动相，样品冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。来进行分离的色谱方法。排阻色谱排阻色谱用化学惰性多孔物质作固定用化学惰性多孔物质作固定相，样品中各组分依据

16、它们相，样品中各组分依据它们在流动相的分子体积大小来在流动相的分子体积大小来进行分离的色谱方法。以水进行分离的色谱方法。以水溶液作流动相的排阻色谱称溶液作流动相的排阻色谱称为为凝胶过滤色谱（凝胶过滤色谱（GFC）；以有机溶剂作流动相的排阻以有机溶剂作流动相的排阻色谱称为色谱称为凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱（GPC）。亲合色谱亲合色谱在基体上固载化生物特在基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固异性吸附的配位体作固定相，以具有一定定相，以具有一定pH值值的缓冲溶液作流动相，的缓冲溶液作流动相，样品中各生物活性分子样品中各生物活性分子组分依据它们与固相基组分依据它们与固相基体上固载的配位体之间体上固载的

17、配位体之间的特异亲合力大小来进的特异亲合力大小来进行分离的色谱方法。行分离的色谱方法。 正相色谱正相色谱（Normal Phase Chromatography） 正相色谱采用硅胶硅胶、氧化铝或带有氰基氰基、二醇基和氨基氨基的极性固定相，非极性流动相操作模式，依据溶质分子的极性大小进行分离。溶质分子与固定相的硅溶质分子与固定相的硅醇基等极性基团产生特异的极性相互作用醇基等极性基团产生特异的极性相互作用，极性相互作用大的保留时间大，反之保留时间小。 硅胶吸附色谱硅胶吸附色谱（液固色谱）（液固色谱） 键合相正相色谱键合相正相色谱（氰基氰基和氨基柱）氨基柱） 正相色谱中色谱柱强度：硅胶柱硅胶柱 氧化

18、铝柱氧化铝柱 氨基柱氨基柱 二醇基柱二醇基柱 氰基柱氰基柱 液固吸附色谱液固吸附色谱 液固色谱的分离基础是样品组分分子与固体吸附剂表面活性点上的竞争吸附以及组分分子与流动相分子的相互作用。 液固吸附色谱适合分离那些能溶于有机溶剂、具有中液固吸附色谱适合分离那些能溶于有机溶剂、具有中等分子量的组分等分子量的组分, , 它能分离不同类型的化合物它能分离不同类型的化合物, , 如具有如具有不同取代基不同取代基, , 或取代基相同但其数目不同的化合物。或取代基相同但其数目不同的化合物。 对于异构体的分离对于异构体的分离, , 液固吸附色谱比其它液相液固吸附色谱比其它液相色谱有更高的选择性。色谱有更高的

19、选择性。如反相色谱中双键位置不同的异构体不能理想分离时, 可选用硅胶吸附或涂渍银离子的硅胶吸附色谱分离。一、原理一、原理 在吸附色谱过程中, 样品分子通过色谱柱时, 溶质的保留受到固定相的吸附力和流动相的溶解力/“拉力”的竞争作用。对于硅胶极性吸附剂对于硅胶极性吸附剂, , 诱导、诱导、氢键这样等是强烈的氢键这样等是强烈的, , 为主要作用力为主要作用力, 而色散力是微不足道的。 根据吸附顶替模型吸附顶替模型, 在进行色谱分离时, 吸附剂表面首先被溶剂分子覆盖形成一单分子层。当溶质分子从流动相引入后, 则会顶替掉吸附剂表面上原来覆盖的溶剂分子而被吸附。SEE吸附色谱保留值的图解表示XX XYY

20、X XYAAAAA取代苯样品在吸附点取代苯样品在吸附点A上的定位上的定位 吸附剂表面被认为是均匀的，被吸附的分子是平躺在表面上的，所以每个吸附分子所需要的吸附面积可以从它的分子尺寸计算出来。因为溶质和溶剂分子的体积不一样, 一般说来前者大于后者, 因此溶质分子(E)与溶剂分子(S)在吸附剂表面上进行竞争吸附的吸附平衡过程为： EMnSS ESnSM n = AS / AM AE ：组分分子吸附在固定相表面上所需的吸附剂面积; AM：流动相分子吸附所需的吸附剂面积； n：每吸附一个溶质分子需要顶替下来的溶剂分子数。 吸附过程的净吸附自由能吸附过程的净吸附自由能： G = GE,S nGS,M G

21、E,M nGS,S 右端的四个G 分别表示溶质和溶剂在固定相和流动相的无量纲摩尔自由能。 在大多数吸附系统中, 流动相的自由能项 GS,M和GE,M 远小于吸附相的自由能项GS,S和GE,S 。若不考虑流动相的影响, 则 G = GE,S nGS,S = SAE 容量因子k 与单位重量吸附剂上被单分子层溶剂覆盖时的吸附体积VS(系吸附剂比表面积的函数)和 G之间有如下关系 ln k = lg VS G为吸附剂的活性系数, 取决于吸附剂的化学性质和水的覆盖量。不随实验条件变化而变化。所以, ln k = lgln k = lg V VS SS S A AE E 这说明液固吸附色谱中溶质的保留值与

22、吸附剂的这说明液固吸附色谱中溶质的保留值与吸附剂的表面积表面积, , 溶质的吸附能和溶剂强度溶质的吸附能和溶剂强度( (按定义按定义, , 单位活单位活性吸附剂表面上溶剂的吸附能性吸附剂表面上溶剂的吸附能, , 即溶剂强度即溶剂强度) )等有等有关。关。 考虑到溶质和溶剂间的相互作用, Snyder后来又在上式中加入一个二级溶剂效应修正项, 以弥补忽略溶剂效应之不足。二、流动相的选择 在硅胶吸附色谱中, 对相对保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用, 流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内, 对选择性的影响一般较小。 液固吸附色谱的流动相值要适当，常用正己烷、正己烷、正庚烷为主正

23、庚烷为主, 添加少量添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。 值得注意的是，有机溶剂中的少量水对分离的影响。三、样品分子结构对保留的影响三、样品分子结构对保留的影响 样品分子的结构决定它们在色谱柱上保留。而对于吸附色谱样品分子的结构决定它们在色谱柱上保留。而对于吸附色谱来说来说, , 主要取决于主要取决于样品分子所含的官能团的类型及其数样品分子所含的官能团的类型及其数目目。一些常见官能团的吸附强度大致如下：。一些常见官能团的吸附强度大致如下： 不吸附：烷烃不吸附：烷烃 弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烃、卤代芳烃弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烃、卤代芳烃中等吸附

24、：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多数羰基化合物中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多数羰基化合物 强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多官能团化合物强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多官能团化合物 样品分子的保留还取决于样品分子的保留还取决于溶质是否能与吸附剂取得最溶质是否能与吸附剂取得最大程度的作用大程度的作用, , 即分子空间效应即分子空间效应。例如：。例如： 与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力；与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力；（位阻效应）（位阻效应） 顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强；顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强； 对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强等等。对

25、位化合物的保留能力可能比邻位化合物强等等。 四、应用举例四、应用举例q 液固色谱的应用特点：液固色谱的应用特点：液固色谱对具有不同极性取代基的化合物表现液固色谱对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的选择性，但对同系物的分离能力较差出较高的选择性，但对同系物的分离能力较差对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆吸附，液固色谱常不能获得满意的分离习惯。吸附，液固色谱常不能获得满意的分离习惯。吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保留值有较大影响留值有较大影响 液固吸附色谱主要用于异构体的分离、族分离液固吸附色谱主要用

26、于异构体的分离、族分离和制备色谱和制备色谱。 1 1苯二胺异构体的分离苯二胺异构体的分离 2 2部分氢化菲的分离部分氢化菲的分离NH2NH2NH2NH2NH2NH2OHOHH2NNH2习题习题1 1 设计一液相色谱法分离苯二胺异构体（色设计一液相色谱法分离苯二胺异构体（色谱类型、色谱柱、流动相、检测条件和出峰顺序谱类型、色谱柱、流动相、检测条件和出峰顺序等）等）习题习题2 2 在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四组分进行分离，最后流出色谱柱的可能是：四组分进行分离，最后流出色谱柱的可能是： a. a. 苯酚苯酚 b. b. 对羟基苯胺对羟基苯胺 c. c.

27、 苯胺苯胺 d. d. 苯苯1210.6 反相键合相色谱RR=H, CH3, (CH2)nCH3 n=1, 2, 3. 键合相色谱是目前HPLC中最常见的分离模式, 约80%的HPLC是采用键合相色谱柱完成的。 烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析一、原理和分离对象一、原理和分离对象1正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱 键合相的种类比较多键合相的种类比较多, , 有非极性、极性和离子交换有非极性、极性和离子交换基团基团, , 可使用于正相、反相和离子交换色谱。如氰基可使用于正相、反相和离子交换色谱。如氰基柱柱, , 即可用作正相色谱即可用作正相色谱, , 又可用作反相色谱。又可用作反相色谱

28、。2 2反相键合相色谱的优缺点反相键合相色谱的优缺点（1 1）反相键合相色谱的优点）反相键合相色谱的优点 样品极性范围宽样品极性范围宽, , 有多种键合相可供选择；有多种键合相可供选择； 使用的溶剂相对便宜使用的溶剂相对便宜, , 平衡速度快；平衡速度快； 离子或离解化合物可用离子对或离子抑制技术分离子或离解化合物可用离子对或离子抑制技术分析；析； 容易操作容易操作, , 分析速度更快分析速度更快, , 重现性更好。重现性更好。（2）键合相的使用极限键合相的使用极限 对于硅基键合相, mp的pH应控制在2.5-7.5：pH7.5, 硅胶可能溶解。 残留的硅羟键可能吸附样品分子或杂质, 引起拖尾

29、, 或tR发生变化；3反相键合相色谱的主要特点反相键合相色谱的主要特点 柱稳定高、寿命长 溶剂相对便宜 流动相可控制条件较多，如溶剂强度范围大（从纯水到非极性溶剂，如Hex），调整pH和I等 含水体系有利于生物样品分析 二、流动相的选择二、流动相的选择 对于正相色谱, 采用弱极性流动相, 极性最弱的组分最先流出, 增加流动相的极性将减少组分的保留。 根据流动相，反相色谱能区别为纯水溶液、混合水混合水溶液溶液和非水反相系统。 反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等，流动相的洗脱强度由有机溶剂浓度及其类型共同决定，这种影响见反相色谱溶剂强度图。 对于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度

30、的关对于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度的关系系，Snyder认为lgk与%B之间呈线行关系： lgk = lgkw-S三、反相色谱的保留机理三、反相色谱的保留机理 疏溶剂理论 溶质保留值公式的讨论正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱固定相固定相极性极性非极性非极性流动相流动相非极性非极性极性极性溶质分子与固定相溶质分子与固定相作用力作用力极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、氢键）氢键）“强烈强烈”色散力（非选择性）色散力（非选择性）“微弱微弱”溶质分子与流动相溶质分子与流动相作用力作用力色散力（非选择性）色散力（非选择性）极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、氢键）氢键）极性溶质极性溶质保留时

31、间随极性增保留时间随极性增大而增大大而增大小或难保留小或难保留非极性溶质非极性溶质小或难保留小或难保留可保留，保留时间可保留，保留时间随极性减少而增大随极性减少而增大（1 1）疏溶剂理论）疏溶剂理论背景：背景：单从溶质与固定相的单从溶质与固定相的非极性与非极性作用力非极性与非极性作用力是不是不能解释反相色谱的保留值大小的，因为这种作用力能解释反相色谱的保留值大小的，因为这种作用力太弱了太弱了。相反，利用疏溶剂效应可以较好地解释反相色谱中关于保留相反，利用疏溶剂效应可以较好地解释反相色谱中关于保留值和选择性的规律。值和选择性的规律。疏溶剂理论的主要意思疏溶剂理论的主要意思是：当一个非极性溶质或分

32、子是：当一个非极性溶质或分子中的中的非极性部分与极性溶剂相接触时非极性部分与极性溶剂相接触时, , 会相互产生斥会相互产生斥力力, , 自由能自由能( ( G)G)增加增加, , 这是一个熵减少过程这是一个熵减少过程。为了弥。为了弥补熵的损失补熵的损失, , 溶剂分子中的非极性部分的结构取向将溶剂分子中的非极性部分的结构取向将导致在极性溶剂中形成一个导致在极性溶剂中形成一个“空腔空腔”。这种效应称为。这种效应称为疏溶剂效应疏溶剂效应。结构化学基础结构化学基础指出：疏水基团相互作用和氢指出：疏水基团相互作用和氢键密切相关，是指极性基团间的静电力和氢键力使键密切相关，是指极性基团间的静电力和氢键力

33、使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团互相聚集所产生的能量效应和熵效应。使疏水基团互相聚集所产生的能量效应和熵效应。在蛋白质分子中，疏水侧链基团如：苯丙氨酸、亮在蛋白质分子中，疏水侧链基团如：苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等较大的疏水基团通常聚集在一起，氨酸、异亮氨酸等较大的疏水基团通常聚集在一起，形成疏水区，大部分存在于分子的内部，这种聚集形成疏水区，大部分存在于分子的内部，这种聚集在一起的作用力即为疏水基团相互作用。在一起的作用力即为疏水基团相互作用。+疏水基团相互作用示意图疏水基团相互作用示意图 上图表示上图表示和和两个疏水基团在

34、水中相互结合两个疏水基团在水中相互结合后，后，从从间非极性面置换出来的水分子成无间非极性面置换出来的水分子成无序状态，使体系的熵增加序状态，使体系的熵增加，减少自由焓，减少自由焓(-TS)(-TS)，使两个非极性区域间的接触稳定化，这种缔合就使两个非极性区域间的接触稳定化，这种缔合就是疏水相互作用的结果，每个亚甲基之间的作用是疏水相互作用的结果，每个亚甲基之间的作用能约达能约达3 kJ3 kJmolmol。 “吸力是吸力是主动的主动的”，如，如GCGC中烃类在非极性固定相中烃类在非极性固定相上的保留大小与色散力有关，尽管它是微弱的，但上的保留大小与色散力有关，尽管它是微弱的，但它又是唯一的它又

35、是唯一的在极性溶剂中的两个非极性溶质的聚集在一起并在极性溶剂中的两个非极性溶质的聚集在一起并非是它们之间的色散力起主导作用，换句话说，这非是它们之间的色散力起主导作用，换句话说，这种聚集并非是主动的，而是种聚集并非是主动的，而是被迫的被迫的，是它们受到更，是它们受到更大的极性溶剂作用（斥）力而被迫聚集在一起。大的极性溶剂作用（斥）力而被迫聚集在一起。 Horvath等人将疏水作用原理疏水作用原理应用于反相高效液相色谱。 根据溶质、溶剂和固定相之间的能量平衡, 导出了利用物质的一般物理化学性质预测反相色谱过程中溶质的保留值公式。基于这一模型, 反相键合相表面被视为一层均匀的非极性烷基链配位基,

36、溶质在反相色谱过程的保留主要不是由于溶质分子与键合相之间弱的非极性相互作用, 而是由于溶质与极性溶剂溶质与极性溶剂之间的排斥力之间的排斥力, , 促使溶质与键合相烃基发生疏水缔合促使溶质与键合相烃基发生疏水缔合。 非离子型溶质与键合相的非极性配位基之间的疏溶剂缔合是可逆的： S L SL疏水作用力，缔合极性作用力，解缔力 缔合作用强度和色谱保留取决于三方面因素：缔合作用强度和色谱保留取决于三方面因素： 溶质分子中非极性部分的总表面积溶质分子中非极性部分的总表面积 键合相上烃基的总表面积键合相上烃基的总表面积 流动相的表面张力等性质流动相的表面张力等性质 G = G = RTlnRTln K ;

37、 k = KV K ; k = KVS SV VM M ; ; = V = VM MV VS S ln k = ln k = lnln G/RTG/RT 按疏溶剂理论，将来自假想气相中的溶质引入溶按疏溶剂理论，将来自假想气相中的溶质引入溶剂的溶解过程所需能量（自由能变化）包括两部分：剂的溶解过程所需能量（自由能变化）包括两部分： 第一部分第一部分是相应于在溶剂中形成一个其大小和形是相应于在溶剂中形成一个其大小和形状与溶质相适应的空腔所需要的能量状与溶质相适应的空腔所需要的能量 G Gc c； 第二部分第二部分是溶质进入空腔后与周围溶剂之间的相是溶质进入空腔后与周围溶剂之间的相互作用能互作用能

38、G Gintint, , 同时伴随有同时伴随有“自由体积自由体积”变化变化RTln(RT/PRTln(RT/P0 0V), V), 即即 G = G = G Gc c G GintintRT lnRT ln (RT/P (RT/P0 0V)V) 其中其中 G Gc c = = ANAN N N A As s( ( e e 1)1) 而而 A = AA = AS S A AL L A ASLSL A AS S、A AL L、A ASLSL：分别为溶质、配位基和缔合物的表面：分别为溶质、配位基和缔合物的表面积；积； A A：S S和和L L缔合时的表面积变化；缔合时的表面积变化； ：溶剂的表面：溶剂的表面张力：张力： e e：把宏观表面张力转换成为微观的一个因：把宏观表面张力转换成为微观的一个因子。子。 G Gintint包括两项包括两项, , 分子间范德华能对缔合的贡献和分子间范德华能对缔合的贡献和( ( G Gv v) )和静电能的