seminaraboutbladdercancer

1、 尿路上皮癌细胞的捕获尿路上皮癌细胞的捕获1、背景、背景2、临床检验金标准、临床检验金标准3、目前可通过尿液检测膀胱癌的方法、目前可通过尿液检测膀胱癌的方法4、我们的目标、我们的目标5、我的想法、我的想法6、调研结果、调研结果1.1.背景背景 膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，在我国每年有约15万的膀胱癌新发病例，而且发病率呈逐年增高之势。由于全部尿路从肾盏、肾盂、输尿管、膀胱及前列腺和尿道均为移行上皮所覆盖，所以90 %以上是移行细胞癌(Transitional Cell Carcinoma, TCC)，少数为鳞癌和腺癌。移行细胞癌患者中近30初诊时已有肌层浸润，其余70为浅表性膀胱癌；2、临

2、床检验金标准、临床检验金标准膀胱镜下活检膀胱镜下活检通过外科手术将膀胱境插入到膀胱内部进行直接地观察，类似于胃境。尿细胞学检查尿细胞学检查对尿液沉渣进行涂片，用特殊的染色剂对细胞内核酸进行染色。通过观察细胞的质核比来判断是否为癌细胞金标准的不足金标准的不足虽然膀胱镜是诊断复发性尿路上皮癌的金标准，但是具有侵入性，且对于微小病变和原位癌不易辨认。尿脱落细胞病理学检查虽然无创伤，然而阳性率仅为8 %46 %，尤其在检测低级别肿瘤时敏感度更低,而且结果判断具有主观性，容易产生偏差。另外，感染、结石等亦可影响细胞的形态而造成假阳性。3、目前可通过尿液检测膀胱癌的方法、目前可通过尿液检测膀胱癌的方法3.

3、1、获、获FDA批准的膀胱癌尿液检测方法批准的膀胱癌尿液检测方法 3.1.1、核基质蛋白、核基质蛋白22（NMP22） 3.1.2、膀胱肿瘤抗原（、膀胱肿瘤抗原（BTA） 3.1.3、免疫细胞学检测（、免疫细胞学检测（ImmunoCyt） 3.1.4、纤维素、纤维素/纤维蛋白原降解产物（纤维蛋白原降解产物（FDP） 3.1.5、荧光原位杂交（、荧光原位杂交（FISH）3.2、研究中的分子诊断方法、研究中的分子诊断方法 3.2.1短串联重复序列（短串联重复序列（STR）检测）检测 3.2.2单核苷酸多态性检测（单核苷酸多态性检测（SNP） 3.2.3甲基化检测甲基化检测 核基质蛋白核基质蛋白22

4、（NMP22）背景：背景：NMP22是组成细胞核内部结构的支架,而且同DNA复制、RNA合成、激素联接、基因表达调控密切相关。膀胱癌时大量肿瘤细胞凋亡并将NMP22释放入尿，使其水平可增高25倍。缺点：缺点：敏感度和特异度不足。敏感度为69.7 %，特异度为78.5 %膀胱肿瘤抗原（膀胱肿瘤抗原（BTA）背景：背景： BTA是膀胱肿瘤在浸润和生长过程中释放的蛋白水解酶降解基底膜的各种成分形成的胶原片段、糖蛋白、蛋白多糖等释放进入膀胱腔内形成的复合物。缺点：缺点：由于敏感度特异度偏低，近年已逐渐被其他方法所取代。敏感度67 %87 % ,特异度49 %70 %免疫细胞学检测（免疫细胞学检测（Im

5、munoCyt）背景：背景：免疫细胞学检测是细胞学和免疫荧光的结合，即用单克隆荧光抗体检测膀胱癌脱落细胞的特异性分子标志物。缺点：缺点：总体敏感度和特异度一般，而且需要专门的实验室和培训技术人员，应用面不广。敏感度86%，特异度79.4% 纤维素纤维素/纤维蛋白原降解产物（纤维蛋白原降解产物（FDP）背景：背景：纤维素/纤维蛋白原降解产物是由纤溶酶作用于纤维素和纤维蛋白原后所产生的蛋白质片段。缺点缺点：前列腺癌、膀胱炎症，尤其是肾盂肾炎的病人，FDP实验很容易出现假阳性。敏感度82.1 %，特异度：85% 背景：背景：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridizat

6、ion ,FISH)是用荧光标记的核酸探针和中期或间期细胞DNA杂交，检测DNA序列及其变化的方法。膀胱癌细胞易发生非随机的染色体改变，包括结构畸变和染色体数目异常。超过50 %膀胱癌患者有此染色体改变，被认为是肿瘤发生的早期事件和关键步骤；缺点：缺点： FISH存在的问题有Ta、Tis期肿瘤相对敏感度较低。常因尿液肿瘤细胞不够而影响特异性。而且高昂的价格和繁琐的操作过程也影响了它的应用和推广。敏感度85%，特异度97%荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）背景：背景：大量研究显示,在TCC中存在总体上染色体的不稳定性,多条染色体多个区段发生LOH。研究证明只需做20个高信息含量位点就可以达到

7、充足的信息量（敏感度95以上）用以检测各种类型膀胱癌，而且不受肿瘤病理分级和分期的影响。缺点：缺点：由于大量的LOH模式尚未清晰，还需要花费大量的时间和精力去研究，再加上MSI分析需要异常细胞含量占到10以上，以及尿沉渣细胞无法满足的大量DNA，这些都限制了它的应用。短串联重复序列（短串联重复序列（STR）检测）检测单核苷酸多态性检测单核苷酸多态性检测背景：背景：检测DNA的单核苷酸多态性（SNP）亦是研究LOH的方法之一。他们大量存在于人类染色体中，大约相隔100300bp就有一个，因此检测SNP比微卫星技术敏感度更高。可以克服肿瘤细胞和炎性细胞难以区分, 高分化癌诊断的阳性率过低等问题。缺

8、点：缺点：使用基因芯片的方法成本比较高，另外尚无证据表明能帮助肿瘤的分级和分期。缺点：缺点： CpG岛是人类基因启动子富含CpG双核苷酸的区域,在正常状态下是未甲基化的,其甲基化状态与基因转录及表达活性有关,并因此影响基因的功能。 CpG岛的过甲基化几乎在每种类型的肿瘤中都有发生,并且涵盖了DNA修复、细胞周期、细胞凋亡、细胞黏附、细胞代谢等各个方面。很多研究人员使用不同的位点组合检测膀胱癌病理标本已经达到了90以上的敏感度和特异度，受尿沉渣细胞量的限制，敏感度普遍稍低，虽然亦有100的报道，但尚缺乏大样本研究证实。缺点：缺点：需要亚硫酸盐处理过夜，步骤较多，费时较长，模板在处理之后变成小片段

9、，影响扩增，泌尿系统其他肿瘤脱落细胞可能会混杂其中影响结果判断。甲基化检测甲基化检测总结：上述方法整体上存在的问题总结：上述方法整体上存在的问题1、特异性、特异性和和敏敏感性感性不足不足2、受其他肿瘤细胞或炎症细胞的影响、受其他肿瘤细胞或炎症细胞的影响3、受尿液中细胞的浓度的影响、受尿液中细胞的浓度的影响如何解决？如何解决？4、我们的目标、我们的目标（没有蛀牙！）（没有蛀牙！）抓住细胞！抓住细胞！简单思路：简单思路：1、通过抗原抗体特异结合从尿液中捕获肿瘤细胞、通过抗原抗体特异结合从尿液中捕获肿瘤细胞2、做免疫荧光杂交坚定所捕获的细胞是否为肿瘤细胞、做免疫荧光杂交坚定所捕获的细胞是否为肿瘤细胞

10、可能存在的问题：可能存在的问题：1、癌细胞在尿液中存活的时间较短、癌细胞在尿液中存活的时间较短2、尿液恶劣的环境对特异性抗体的影响、尿液恶劣的环境对特异性抗体的影响3、尿液中背景较多，干扰实验、尿液中背景较多，干扰实验我的想法：我的想法：尿液收集 过滤、悬浮 再过滤、悬浮 捕获（抗原抗体特异杂交） 洗脱并稀释 免疫荧光染色 荧光筛选。明显的优点明显的优点1、非尿液环境，背景和干扰小、非尿液环境，背景和干扰小2、特异性明显增加、特异性明显增加3、后期如果进行微卫星或甲基化研究，将有非常高的敏感度。、后期如果进行微卫星或甲基化研究，将有非常高的敏感度。可能存在的问题可能存在的问题1、细胞经不起折腾、细胞经不起折腾2、捕获效率可能影响细胞的数量、捕获效率可能影响细胞的数量3、无法排除其他肿瘤细胞的影响、无法排除其他肿瘤细胞的影响调研结果调研结果肿瘤细胞表面抗原肿瘤细胞表面抗原 1、EGFR 2、HER2/c-erbB-2 3、VEGFR(VEGFR1 and VEGFR2) 4、Integrin