实验二 蛋白质N端分析PPT学习教案

1、实验二实验二 蛋白质蛋白质N端分析端分析基本原理基本原理第1页/共22页 荧光试剂荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯（ DNS-Cl ）在）在碱性碱性条件下与氨基酸、肽和蛋白质条件下与氨基酸、肽和蛋白质N末端的氨基反末端的氨基反应，分别生成带有应，分别生成带有的的DNS-氨基酸、氨基酸、DNS-肽、肽、 DNS-蛋白质蛋白质。灵敏度。灵敏度10-10摩尔。摩尔。DansylCl 标记标记N末端氨基末端氨基酸酸第2页/共22页第3页/共22页DNS-肽和 DNS-蛋白质的水解DNS-肽和肽和 DNS-蛋白质被蛋白质被6.0 mol/L的盐酸的盐酸水解水解，释释放出带有放出带有 N末端标记的

2、末端标记的DNS-氨基酸氨基酸。第4页/共22页第5页/共22页第6页/共22页BCAC第7页/共22页聚酰胺（尼龙）：聚酰胺（尼龙）： 己二酸己二酸和和己二胺己二胺的聚合物的聚合物 nHOOC(CH2)4COOH + nH2N (CH2) 6NH2 -HN-CO -(CH2)4 CO-NH (CH2) 6NH-CO- 分子中含有大量的分子中含有大量的酰胺基团酰胺基团聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析第8页/共22页聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜：将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥后制得的薄膜。后制得的薄膜。 聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜含有含有-CO-和和-NH-基团，能与被分离的基

3、团，能与被分离的化合物形成氢键，因此可以吸附酚类、化合物形成氢键，因此可以吸附酚类、酸类酸类（核苷（核苷酸、氨基酸）、醌类、硝基及胺基等化合物。酸、氨基酸）、醌类、硝基及胺基等化合物。 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析第9页/共22页分离原理：分离原理： 各种被分离物在展层剂中的各种被分离物在展层剂中的溶解度溶解度及及被分离化合物与聚酰胺被分离化合物与聚酰胺形成氢键能力形成氢键能力的大的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度不同。速度不同。聚酰胺薄膜层析第10页/共22页展层过程：展层过程： 将将DNS-氨基酸点在聚酰胺薄膜上（固定相），氨基酸点在聚酰胺薄膜

4、上（固定相）， 薄膜的底端浸泡在展层剂中。展层剂（流动相）在薄膜的底端浸泡在展层剂中。展层剂（流动相）在 毛细管作用下向薄膜的上端移动，毛细管作用下向薄膜的上端移动，DNS-氨基酸随展氨基酸随展层剂向薄膜的上端移动。层剂向薄膜的上端移动。聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析第11页/共22页第12页/共22页聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析迁移率：迁移率：Rf =被分离化合物的移动距离被分离化合物的移动距离溶剂前沿的移动距离溶剂前沿的移动距离第13页/共22页实验步实验步骤骤第14页/共22页1、加样、加样（加样前把试管洗干净！加样前把试管洗干净！） 试管试管 1、 0.2ml Phe 溶液溶液0.2ml

5、 DNS-Cl溶液溶液 试管试管2、 0.2ml Gly 溶液溶液0.2ml DNS-Cl溶液溶液 2、薄膜封口，、薄膜封口，40C反应反应30min。 3、 在电炉上将在电炉上将液体蒸干。液体蒸干。 4、 各加入各加入0.1ml 1.0mol/L HCl。 制备制备DNS-氨基酸氨基酸第15页/共22页1、在、在DNS胰岛素样品加入等体积的胰岛素样品加入等体积的 6.0mol/L HCl，酒精灯上封口。，酒精灯上封口。2、 110C水解水解12小时。小时。老师准备！老师准备！DNS胰岛素的水解胰岛素的水解第16页/共22页 1、将样品、将样品0.1mL分别转入分别转入0.5ml离心管中离心管中 2、 加入等体积加入等体积乙酸乙酯乙酸乙酯，萃取，萃取2分钟，使分钟，使DNS-氨氨基酸进入乙酸乙酯层。基酸进入乙酸乙酯层。 DNS-氨基酸的萃取氨基酸的萃取第17页/共22页点点 样样注意：1、用铅笔轻轻定位点样点。2、点样点距薄膜底端1.5cm第18页/共22页展 层展层剂：展层剂：甲酸（甲酸（88%）：水）：水=1.5 ：100（V/V） 1、展层、展层10-15分钟，等溶剂前沿到分钟，等溶剂前沿到达离聚酰胺薄膜顶端达离聚酰胺薄膜顶端1.0 cm 时，时，停止展层