GFP功能性包涵体

1、GFP折叠突变体指示功能性包折叠突变体指示功能性包涵体产量涵体产量 研究背景研究背景 研究目的及意义研究目的及意义 结果分析结果分析 结论结论 致谢致谢1.1.研究背景研究背景 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统优点：优点：简单与经济简单与经济遗传背景清晰遗传背景清晰生长周期快生长周期快表达蛋白产量高表达蛋白产量高培养简单且易于操培养简单且易于操作作缺陷：缺陷： 缺乏真核细胞蛋白质缺乏真核细胞蛋白质翻译后修饰翻译后修饰 缺乏一些真核细胞常缺乏一些真核细胞常用的用的 tRNAtRNA 表达异源蛋白常形成表达异源蛋白常形成包涵体包涵体包涵体包涵体 传统包涵体传统包涵体（Inclusion Bodie

2、s，IBs）是是指不可溶、无活性的蛋白聚集体，一般指不可溶、无活性的蛋白聚集体，一般呈杆呈杆状或卵圆形状或卵圆形。主要缺点：主要缺点：需经过复杂的蛋白质变复性过需经过复杂的蛋白质变复性过程以恢复其生物活性程以恢复其生物活性。包涵体包涵体溶解性：溶解性：不溶于水，只溶于变性剂不溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等如尿素、盐酸胍等。功能性包涵体功能性包涵体 近几年研究表明许多包涵体本身近几年研究表明许多包涵体本身具具有生有生物活性，人们把这种包涵体命名为功能性包物活性，人们把这种包涵体命名为功能性包涵体（涵体（active inclusion bodies，AIBs）。优点：优点： 蛋白稳定、易纯

3、化蛋白稳定、易纯化产量高、成本低产量高、成本低对宿主细胞毒性小对宿主细胞毒性小无需变复性过程即可发挥生物活性无需变复性过程即可发挥生物活性影响功能性包涵体形成的因素影响功能性包涵体形成的因素 1 1、表达量过高表达量过高( (二硫键二硫键) ) 2 2、重组蛋白重组蛋白的的氨基氨基酸酸组成组成（含（含硫氨基酸硫氨基酸） 3 3、重组蛋白重组蛋白所处的环境所处的环境（高温、（高温、PHPH） 4 4、重组蛋白重组蛋白是异源蛋白是异源蛋白( (缺乏缺乏真核生真核生物物中中翻译后翻译后修修饰饰所需酶所需酶) ) 5 5、宿主选择宿主选择（如如选择选择DnaKDnaK或或ClpPClpP缺失的突变株缺

4、失的突变株） 6 6、融合融合突变的分子伴侣突变的分子伴侣（VP1,MalE31VP1,MalE31，CBDclosCBDclos） 7 7、疏水性自聚集肽、疏水性自聚集肽（18A18A，ELK16ELK16）自组装肽自组装肽ELK16 ELK16优点：优点： 可有效诱导功能性包涵体的形成可有效诱导功能性包涵体的形成 融合蛋白表达，融合蛋白表达，不会干扰细胞的不会干扰细胞的正常正常生长生长ELK16序列序列: :LELELKLKLELELKLK功能性包涵体的应用功能性包涵体的应用作为作为固定化酶固定化酶应用于应用于生物催化生物催化（ Roessl U et al，Biotechnol Lett

5、, 2010, 32:341-350）作为生物材料应用作为生物材料应用于医学领域于医学领域（Vzquez E et al， Adv Mater 2012, 24:17421747 ）增强对蛋白折叠增强对蛋白折叠机制机制的理解的理解（Garca-Fruits E et al， Cell Press, 2012, 30( 2) : 65- 70 ） 可以形成功能性包涵体的模式蛋白包括：可以形成功能性包涵体的模式蛋白包括：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-galactosidase) )D-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶( (D-amino acid oxidase) )麦芽糊精磷酸化酶麦芽糊精磷酸化酶( (ma

6、ltodextrin phosphorylase) )绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（green fluorescent proteingreen fluorescent protein，GFP)GFP)选择选择GFP作为报告蛋白作为报告蛋白的原因的原因自发荧光、荧光性质稳定自发荧光、荧光性质稳定可形成功能性包涵体可形成功能性包涵体存在多种折叠性不同的存在多种折叠性不同的GFP突变体突变体 四种四种GFP折叠突变体折叠突变体 EmGFP: :祖母绿绿色荧光蛋白突变体祖母绿绿色荧光蛋白突变体 sfGFP: :超折叠绿色荧光蛋白突变体超折叠绿色荧光蛋白突变体 SeGFP:新型超折叠绿色荧光突变体新型超折

7、叠绿色荧光突变体 cpGFP: :循环绿色荧光蛋白突变体循环绿色荧光蛋白突变体2.2.研究目的及意义研究目的及意义 一、分析四种一、分析四种GFP突变体蛋白的光谱学性质与荧突变体蛋白的光谱学性质与荧光强度；光强度； 二、分析四种二、分析四种GFP突变体蛋白对不同变性剂的耐突变体蛋白对不同变性剂的耐受性，探明不同突变体的折叠稳定性；受性，探明不同突变体的折叠稳定性； 三、三、GFP折叠折叠突变体与突变体与ELK16融合表达，诱导其融合表达，诱导其形成功能性包涵体；形成功能性包涵体； 四、四、比较比较四种四种GFP突变体所形成的包涵体产量，突变体所形成的包涵体产量，探明蛋白折叠性与包涵体产量的相关

8、性；探明蛋白折叠性与包涵体产量的相关性； 五、五、比较比较形成包涵体的全细胞的荧光强度和体外形成包涵体的全细胞的荧光强度和体外纯化包涵体的荧光强度，探明蛋白折叠性与包涵纯化包涵体的荧光强度，探明蛋白折叠性与包涵体活性的相关性。体活性的相关性。3.3.结果分析结果分析图图1 EmGFP 、SeGFP、sfGFP的氨基酸序列比对的氨基酸序列比对SeGFP与与EmGFP相比有六个氨基酸残基突变（相比有六个氨基酸残基突变（S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和和A206V）SeGFP与与sfGFP相比有六个氨基酸残基不同（相比有六个氨基酸残基不同（A72S、Q80R、K149N、V1

9、63A、T167I和和L231H）3.1 四种四种GFP重组基因的氨基酸序列比对重组基因的氨基酸序列比对图图2 cpGFP的氨基酸序列的氨基酸序列SeGFP氨基酸序列氨基酸序列C端的端的81个氨基酸装在个氨基酸装在cpGFP的的N端端，N端的端的156个氨基酸装在个氨基酸装在cpGFP的的C端端，中间用中间用GGGS Linker进行连接进行连接，与与ELK16之间用之间用PT linker连接。连接。3.2 四种四种GFP重组蛋白的表达与纯化重组蛋白的表达与纯化电泳显示四种电泳显示四种GFP均为一主均为一主条带，纯度相对较高。条带，纯度相对较高。 图图3 四种重组四种重组GFP在大肠杆在大肠

10、杆菌中的表达与纯化菌中的表达与纯化3.3四种绿色荧光蛋白的光谱扫描四种绿色荧光蛋白的光谱扫描 EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP分别在分别在485nm、485 nm、483 nm、485 nm有吸收峰有吸收峰,说明四种绿色荧光蛋白突变体的光谱性质未发生说明四种绿色荧光蛋白突变体的光谱性质未发生明显变化。明显变化。图图4 GFP纯化蛋白的光谱纯化蛋白的光谱扫描扫描 A：紫外光谱；紫外光谱；B：激发光谱激发光谱 ；C：发射光谱：发射光谱图图4-5 纯化蛋白纯化蛋白EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的的激发和发射光谱激发和发射光谱 A：激发光谱：激发光谱 ； B：发射光谱

11、：发射光谱 激发图谱显示分别在激发图谱显示分别在486 nm、484 nm、484 nm、488 nm有最有最大吸收峰大吸收峰,发射光谱显示分别在发射光谱显示分别在509 nm、510 nm、510 nm、510 nm有最大吸收峰有最大吸收峰。3.4 四种四种GFP纯化蛋白荧光强度与折叠稳定性检测纯化蛋白荧光强度与折叠稳定性检测图图5 纯化蛋白纯化蛋白EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的的荧光强度荧光强度 SeGFP、sfGFP与与EmGFP、cpGFP相比相比没有发生明显的没有发生明显的荧光增强，四种荧光增强，四种GFP水溶性水溶性蛋白蛋白荧光强度无较大差异。荧光强度无较大差异

12、。图图6 尿素和盐酸胍对尿素和盐酸胍对GFP突变体的稳定性分析突变体的稳定性分析A：尿素：尿素 ； B：盐酸胍：盐酸胍3.5 四种四种GFP功能性包涵体的定性与定量分析功能性包涵体的定性与定量分析图图7功能性包涵体的定性与定量分析功能性包涵体的定性与定量分析A:重组蛋白重组蛋白SDS-PAGE电泳和蛋白印迹电泳和蛋白印迹SDS-PAGE电泳显示，四种重组蛋白的上清电泳显示，四种重组蛋白的上清、沉淀、沉淀均均存在一条特异主带存在一条特异主带。进一步用蛋白印进一步用蛋白印迹验证该表达条带为含有迹验证该表达条带为含有His-tag的的目的目的蛋白蛋白。图图4-9 沉淀与细胞的湿重比值沉淀与细胞的湿重

13、比值 结果显示包涵体产量结果显示包涵体产量cpGFPEmGFPSeGFPsfGFP，说明，说明包涵体产量与折叠性成包涵体产量与折叠性成反比关系。反比关系。4.6功能性包涵体的激光共聚焦显微镜分析功能性包涵体的激光共聚焦显微镜分析图图4-10 功能性包涵体在大肠杆菌功能性包涵体在大肠杆菌BL21(DE3)中中的细胞定位的细胞定位A：GFP B：GFP-ELK164.7 FTIR分析功能性包涵体的二级结构分析功能性包涵体的二级结构图图4-11 GFP-ELK16 聚集体的傅里叶红外光谱分析聚集体的傅里叶红外光谱分析 表明功能性包涵体中表明功能性包涵体中GFP蛋白的蛋白的折叠具备完整性折叠具备完整性

14、，GFP-ELK16聚集体中聚集体中存在存在疏水疏水-折叠的类淀粉结构折叠的类淀粉结构。4.8不同温度条件下不同温度条件下GFP-ELK16重组细胞荧光强度的动态分析重组细胞荧光强度的动态分析图图4-12 不同温度诱导重组细胞荧光强度不同温度诱导重组细胞荧光强度图图4-13 不同温度诱导重组细胞的不同温度诱导重组细胞的OD600 结果显示重组细胞的结果显示重组细胞的OD600值无较大差异，值无较大差异，说说明明GFP-ELK16重组重组细胞荧光强度是由于形成功能性包涵体而产生的荧光差异，而不是由细胞荧光强度是由于形成功能性包涵体而产生的荧光差异，而不是由于细胞表达量的影响产生的差异于细胞表达量

15、的影响产生的差异。4.9 功能性包涵体的活性分析功能性包涵体的活性分析图图4-14 重组细胞上清和沉淀的荧光分析重组细胞上清和沉淀的荧光分析 重组细胞沉淀的荧光值均高于上清的荧光值重组细胞沉淀的荧光值均高于上清的荧光值，沉淀的荧光值沉淀的荧光值SeGFP sfGFP cpGFP EmGFP。4.10 包涵体的形成对细胞生长的影响分析包涵体的形成对细胞生长的影响分析图图4-15 GFP、GFP-ELK16重组细重组细胞相对胞相对OD600 结果显示结果显示，四种四种GFP/ GFP-ELK16的值分别为的值分别为99.6%、91.8%、98.2%、99.0%，说明，说明ELK16融合融合蛋白表达形成包涵体不影蛋白表达形成包涵体不影响细胞的正常生长。响细胞的正常生长。4.4.结论结论 1. EmGFP 、SeGFP、cpGFP、sfGFP的光谱学性质没的光谱学性质没有较大差异；有较大差异； 2. ELK16可有效诱导可有效诱导GFP功能性包涵体的形成，且不影功能性包涵体的形成，且不影响重组细胞的生长；响重组细