11DNA重组技术的基本工具_2

1、能否让禾本科的植物也能够固定空气能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？中的氮？能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝？蚕丝？能否让微生物产生出人的胰岛素、干能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？扰素等珍贵的药物？ 经过多年的努力，科学家于经过多年的努力，科学家于2020世纪世纪7070年代创立了可以定向改造生物的新技年代创立了可以定向改造生物的新技术术基因工程基因工程。19731973年，美国科学家科恩将两种不同来源的年，美国科学家科恩将两种不同来源的DNADNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，创立了定向改造生物的新技术中的

2、表达，创立了定向改造生物的新技术基因工程基因工程。专题专题1 1 基因工程基因工程从科技探索之路中可以看出：从科技探索之路中可以看出： 说明没有说明没有 的研究成果，没有的研究成果，没有 的创新的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。阅读选修阅读选修3 3现代生物科技专题的目录，找出现现代生物科技专题的目录，找出现代生物科技包括哪些工程？代生物科技包括哪些工程？基因工程、蛋白质工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程、细胞工程、 胚胎工程、胚胎工程、 生态工程生态工程基础理论基础理论技术技术 什么叫基因工程？什么叫基因工程？ 基因工程是指按照人

3、们的愿望，进行严格的设基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过计，并通过体外体外DNADNA重组重组和和转基因技术转基因技术，赋予生物赋予生物以新的遗传特性以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的，从而创造出更符合人们需要的新新的生物类型的生物类型和和生物产品生物产品。由于基因工程是在。由于基因工程是在DNADNA分分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNADNA重组重组技术。技术。一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果DNADNA重组技术

4、重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平新生物类型和生物产品新生物类型和生物产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组（定向）（定向）它是一种按照人们愿望，定向改造生物遗传特性的它是一种按照人们愿望，定向改造生物遗传特性的技术。技术。 在在DNADNA分子水平上进行操作。分子水平上进行操作。 是在体外进行的人为的基因重组。是在体外进行的人为的基因重组。 一旦成功，便可遗传。一旦成功，便可遗传。 主要技术是主要技术是体外体外DNADNA重组技术重组技术和和转基因技术。转基因技术。基因工程的特点：基因工程的特点：转基因抗虫棉转基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉

5、基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程： 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？导入导入普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有抗虫特性有抗虫特性) )重组重组DNADNA形成形成关键步骤一：关键步骤一：关键步骤二：关键步骤二：关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来形成重组形成重组DNADNA重组重组DNADNA导入受体导入受体( (棉花棉花) )细胞细胞解

6、决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”运载体运载体（一）（一）“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、基因操作的工具二、基因操作的工具切割切割DNADNA的工具是的工具是限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶，又称，又称限制酶限制酶。这类这类酶主要从原核生物中分离纯化出来的，迄酶主要从原核生物中分离纯化出来的，迄

7、今为止已从近今为止已从近300300种不同的微生物中分离出了种不同的微生物中分离出了约约40004000种限制酶。种限制酶。（简称限制酶）（简称限制酶）限制性核酸内切酶能够限制性核酸内切酶能够识别识别双链双链DNADNA分子分子的某种特定核的某种特定核苷酸序列苷酸序列, ,并且使每一条链中特定部位的并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之两个核苷酸之间间的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 AAATTGCCTTAAG识别双链识别双链DNADNA分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之并且使每一条链中特

8、定部位的两个核苷酸之间的间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来中分离纯化出来的。的。40004000种。种。 1 1、来源：、来源： 2 2、种类：、种类：3 3、作用：、作用：4 4、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶 “ “分子手术刀分子手术刀”黏性末端黏性末端平末端平末端能将外来的能将外来的DNADNA切断切断，由于这种切割作用是在，由于这种切割作用是在DNADNA分子分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。内部进行的，故名限制性核酸内切酶。 大肠杆菌的一种限制酶（大肠杆菌的一种限制酶（EcoREc

9、oR）能识别）能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。限制酶限制酶 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 当限制酶在它识别的中心轴线两侧将当限制酶在它识别的中心轴线两侧将DNADNA两条链切开时，切开的两条链切开时，切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配它们之间正好互补配对对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开在它识别序列的中心轴线处切开时，时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口

10、，是平整平整的，的，这样的切口叫这样的切口叫平末端平末端。 DNADNA分子经限制性核酸内切酶切割产生的分子经限制性核酸内切酶切割产生的 DNADNA片段末端通常有哪两种形式？片段末端通常有哪两种形式？那么，在中心轴线两侧的双链那么，在中心轴线两侧的双链DNADNA上的碱基上的碱基有什么特点呢？有什么特点呢？不管是产生黏性末端还是平末端，在中心轴线两不管是产生黏性末端还是平末端，在中心轴线两侧的双链侧的双链DNADNA上的上的碱基是旋转对称的。碱基是旋转对称的。 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏

11、性末可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。会产生相同的黏性末端。是不是是不是把两者的黏性末端黏合起来，把两者的黏性末端黏合起来，这样就形这样就形成了重组的成了重组的DNADNA分子了分子了? ? 实际还不够实际还不够, ,还还需要需要DNADNA连接酶进行连接。连接酶进行连接。一种限制酶只能识别和切断特定的核苷酸序列，一种限制酶只能识别和切断特定的核苷酸序列，这是由

12、限制酶的性质（这是由限制酶的性质（专一性或特异性专一性或特异性）决定）决定的。的。中轴线中轴线思考：限制酶所识别的序列有什么特点？思考：限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，都可以找限制酶所识别的序列，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链的双链DNADNA上的上的碱基是旋转对称碱基是旋转对称的的。限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开吗？切开吗？问题探讨：问题探讨：限制酶从哪里寻找？限制酶从哪里寻找？提示：联想以前学过的内容提示：联想以前学过的内容噬菌体侵染细菌的噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容

13、易受到自然界实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源外源DNADNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？化而不绝灭，有何保护机制？原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防原核生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵入时，会利用侵入时，会利用限制酶将外源限制酶将外源DNADNA切割掉，以保证自身的安全。所切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源以

14、，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。使之失效，从而达到保护自身的目的。迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，联系你已有的知识，是从细菌或霉菌中提取出来的，联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？是因为微生物在长期进化过程中，含有某种限制是因为微生物在长期进化过程中，含有某种限制酶的细胞，酶的细胞，其其DNADNA分子中或者不具备这种限制酶的分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通

15、过甲基化酶将甲基转移到或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵的入侵 将切下来的将切下来的DNADNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNADNA分子分子, , 是靠是靠DNADNA连接酶来完成的。连接酶来完成的。 19671967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条种能够将两条DNADNA链连接起来的酶，称之链连接

16、起来的酶，称之DNADNA连接酶。连接酶。 根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称为类：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶; ;另一类是从另一类是从T T4 4噬菌体中分噬菌体中分离出来的离出来的, ,称为称为T T4 4DNADNA连接酶连接酶。 这两类酶都是将双链这两类酶都是将双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起起来，来，恢复恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别：，但这两种酶的作用有所差别：E.co

17、liDNAE.coliDNA连接酶只能将双链连接酶只能将双链DNADNA片段互补片段互补的黏性末端之间连接起来，的黏性末端之间连接起来，不能将双链不能将双链DNADNA片段平末端之间进行连接。而片段平末端之间进行连接。而T T4 4DNADNA连接酶连接酶既可以既可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段互补的黏性末片段互补的黏性末端，又可以端，又可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段的平末端，片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。但连接平末端之间的效率比较低。（二）（二） “ “分子缝合针分子缝合针” ” DNA DNA连接酶连接酶1 1、种类：、种类： 两类两类EcoliEcoli

18、DNA DNA连接酶连接酶T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶 磷酸二酯键磷酸二酯键 DNADNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的来，这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。2 2、作用部位：、作用部位：基因工程中所用的连接酶有两种：一种是基因工程中所用的连接酶有两种：一种是EcoliDNAEcoliDNA连连接酶。另一种是接酶。另一种是T T4 4DNADNA连接酶。这两种连接酶都是连接连接酶。这两种连接酶都是连接双链双链DNADNA的缺口，不能连接单链

19、的缺口，不能连接单链DNADNA。DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现二者的差别主要表现在什么地方呢在什么地方呢？DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？不是。不是。 DNADNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；段的末端上，形成磷酸二酯键；而而DNADNA连接酶是在连接酶是在两个两个DNADNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与苷酸与DNADN

20、A片段之间形成磷酸二酯键片段之间形成磷酸二酯键。 DNADNA聚合酶是以聚合酶是以DNADNA一条链为模板，将单个核苷酸一条链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的子链；而通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的子链；而DNADNA连接酶是将连接酶是将DNADNA双链上的两个缺口同时连接起来。双链上的两个缺口同时连接起来。因此因此DNADNA连接酶不需要模板连接酶不需要模板。二者虽然化学本质都是蛋白质，但组成和性质二者虽然化学本质都是蛋白质，但组成和性质各不相同。各不相同。导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具载体。载体。作用一：作为运载工具，将外源基因作用一：作为运载工具，将

21、外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )转转移到受体细胞移到受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )中去。中去。作用二：利用载体在受体细胞作用二：利用载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内，对外内，对外源基因源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进行大量复制。进行大量复制。三、三、 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车” ” 用什么方法才能将用什么方法才能将外源基因外源基因（目的基因目的基因）送入受）送入受体细胞中呢？体细胞中呢？质粒是基因工程最常用的载体。质粒是基因工程最常用的载体。最常用的质粒是大肠杆菌质粒。最常用的质粒是大肠杆菌质粒。质粒是一种裸露的、结构简单、

22、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核独立于细菌拟核DNADNA之外之外，并具有，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的很小双链环状双链环状DNADNA分子分子。质粒质粒DNADNA上有一个至多个上有一个至多个限制酶切割位点限制酶切割位点，供外源，供外源DNADNA片段（基因）插入其中。片段（基因）插入其中。携带外源携带外源DNADNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体进行自我复制，或整合到染色体DNADNA上，随染色体上，随染色体DNADNA进行同步复制。进行同步复制。质粒质粒DNADNA上有特殊的上有特殊的标记基因标记基因，

23、如四环素抗性基，如四环素抗性基因、氨卞青霉素抗性基因等标记基因，供重组因、氨卞青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。在基因工程使用的载体除在基因工程使用的载体除质粒质粒外，还有外，还有噬菌体的噬菌体的衍生物衍生物、动植物病毒动植物病毒等。等。它们来源不同，在它们来源不同，在大小大小、结构结构、复制复制以及以及插入片段插入片段大小大小上也有很大差别。上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为具，因此将它们比喻为“分子运输车分子运输车”。将外源基因送入受将外源基因送入受体细胞。体细胞。

24、1 1、作用：、作用：2 2、条件：、条件：能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存。载体载体DNADNA必须有一个或多个必须有一个或多个限制酶切点限制酶切点，以便目的基因，以便目的基因插入到载体上去。插入到载体上去。具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选。载体载体DNADNA必须是必须是安全安全的的, ,不会对受体细胞有害。不会对受体细胞有害。载体载体DNADNA分子分子大小应适合大小应适合, ,以便提取和在体外进行操作。以便提取和在体外进行操作。3 3、常用种类：、常用种类：质粒、质粒、噬菌体衍生物和一些动植物病毒。噬菌体衍生物和一些动植物病毒

25、。（三）基因进入受体细胞的载体（三）基因进入受体细胞的载体 “分子运输车分子运输车” ” 1.1.重组重组DNADNA不能复制，就可能丢失。不能复制，就可能丢失。2.2.没有一个至多个没有一个至多个限制酶的切割位点限制酶的切割位点，就不能，就不能进行进行DNADNA的重组。的重组。3.3.载体上没有没有标记基因，我们用肉眼又看载体上没有没有标记基因，我们用肉眼又看不到载体是否真正进入，鉴定困难。不到载体是否真正进入，鉴定困难。4.4. 载体必须对细胞无害。不能有害于受体细胞，载体必须对细胞无害。不能有害于受体细胞，影响其生命活动的正常进行。影响其生命活动的正常进行。原因：原因： 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中含有标记最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中含有标记基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素的抗性基因。基因，如四环素抗性基因、氨卞青霉素的抗性基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有影响，能在宿主质粒的存在与否对宿主细胞生存没有影响，能在宿主细胞内进行复制。细胞内进行复制。质粒的特点质粒的特点1 1、细菌拟核、细菌拟核DNADNA分子外能自主复制的小型环状分子外能自主复制的小型环状DNADNA分子；分子；2 2、质粒的存在对宿主细胞无影响；、质粒的存在对宿主细胞无影响；3 3、质粒能在宿主细胞内进行复制。、质粒能在宿主细胞内进行复制。能够在宿主细胞内复制并稳定地保存