超分辨成像-高婧

1、利用超分辨显微镜研究利用超分辨显微镜研究蛋白质分布及定位蛋白质分布及定位 报告人：高报告人：高 婧婧指导指导老师：王宏达老师：王宏达 研究员研究员单位：中国科学院长春应用化学研究所单位：中国科学院长春应用化学研究所20152015. . 6.6. 10 10 内容纲要内容纲要1. 研究背景2. EGFR的质膜成簇分布3. EGFR成簇的调控机制4. 不同细胞周期下STAT1的胞内定位21. 1. 研究背景研究背景光学显微镜的分辨极限在x-y水平方向上，PSF的FWHM约为xy0.61/NABo Huang, et al. Cell, 20103超分辨显微镜的简介超分辨显微镜的简介 利用图样式照

2、明实现超分辨成像受激发射损耗显微镜(STED)饱和结构照明显微镜(SSIM)可逆的饱和光学线性荧光跃迁显微镜(RESOLFT) 另一种是基于单个荧光分子的定位(直接)随机光学重建显微镜(STORM, dSTORM)光激活定位显微镜(PALM)4超分辨定位显微镜的机理超分辨定位显微镜的机理van de Linde, S., et al. Chem. Biol, 20135超分辨显微镜的应用超分辨显微镜的应用分别用Alexa Fluor532和Alexa Fluor647双标微管，进行双色dSTORM成像 A. Lampe, et.al, Biol. Cell, 201262.EGFR2.EGFR

3、的质膜成簇分布的质膜成簇分布 表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种主要定位于细胞膜的跨膜受体酪氨酸激酶，其配体是EGF生长因子家族的成员，比如EGF或TGF。Citri, A. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 20067促进DNA合成和细胞增殖，调控细胞迁移、存活、黏附以及抗凋亡等生命过程 EGFR结构及其激活过程结构及其激活过程Endres NF, et. al., Curr. Opin. Struct. Biol., 20118EGFR质膜上成簇分布质膜上成簇分布EGFR蛋白以Alexa

4、647偶联的Cetuximab单抗标记标尺：10 mLCNL 人肺癌细胞 (LC) 正常肺上皮细胞 (NL)910COS-7细胞上细胞上EGFR分布分布标尺：10 m11小结小结EGFR在细胞膜上以蛋白簇的形式存在。EGFR蛋白簇在不同细胞表面的分布和形态不同，在人肺癌细胞上蛋白簇的数目比正常肺细胞上多，尺寸也更大。EGFR蛋白簇在同一种细胞的不同表面分布情况也不同，上表面形成的蛋白簇与下表面相比更多更大，而悬浮细胞膜上EGFR的簇数目和尺寸则介于二者之间，表明细胞极性和外界环境因素对EGFR成簇均有影响。123. 3. EGFR成簇机理的调控成簇机理的调控EGFR蛋白簇与脂筏共定位蛋白簇与脂

5、筏共定位标尺： 10 m 和 200 nm13MCD破坏脂筏影响破坏脂筏影响EGFR蛋白簇蛋白簇标尺：10 m14apical basalPIP2参与调控参与调控EGFR蛋白簇形成蛋白簇形成dSTORM与PALM双色成像COS-7细胞膜上PIP2与EGFR簇EGFR：Alexa647偶联Cetuximab标记PIP2: PH-PLC-mEos3.2标记标尺： 10 m 和 200 nmEGFRPIP212315水解水解PIP2抑制抑制EGFR蛋白簇形成蛋白簇形成CtrlSJ2标尺： 10 m16JM区与区与PIP2的结合介导的结合介导EGFR成簇成簇WTPMDM标尺： 10 m293T cel

6、l1718离子型蛋白离子型蛋白-磷脂相互作用介导的磷脂相互作用介导的EGFR成簇模型成簇模型19小结小结双色成像显示EGFR与脂筏共定位，表明脂筏在EGFR成簇中起一定作用。酸性磷脂PIP2参与介导了EGFR蛋白簇的形成。EGFR富含正电荷氨基酸残基的近膜区(JM区)通过结合PIP2分子与质膜相互作用，在EGFR成簇和信号激活过程中有重要作用。204.4.不同细胞周期下不同细胞周期下STAT1的胞内定位的胞内定位STAT 简介简介Signal transducer and activator of transcription 信号传导和转录激活因子家族成员：STAT1, STAT2, STAT

7、3, STAT4, STAT5A, STAT5B和STAT6蛋白结构和功能域：N端保守序列(ND)、卷曲结构域(COILED COIL)、DNA结合区(DNA)、涉及转录的连接区(LD)、SH2结构域(SH2)、转录激活区(TAD)；所有STAT蛋白均有Tyr磷酸化位点，STATs 1, 3, 4, 5A和5B还有Ser磷酸化位点。Horvath, C. M., et.al, TiBS, 200021STAT入核过程入核过程Reich, N. C., et.al, Nat. Rev. Immunol., 2006 生长因子/细胞因子与受体结合STAT被JAK或PTK磷酸化聚合为同源或异源二聚体

8、进入细胞核与靶基因特定位点结合促进转录22 发育、增殖、免疫、存活发育、增殖、免疫、存活细胞周期和同步化处理细胞周期和同步化处理胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法，使细胞处于G1/S期交界处，不同时间点收集即得不同周期的细胞 细胞周期概念图 细胞同步化 23STAT1在间期细胞内的分布在间期细胞内的分布标尺：10 m 和 2 m24刺激前 加EGF刺激使其入核STAT1在分裂期细胞内的分布在分裂期细胞内的分布前期中期后期末期标尺：10 m25不同细胞周期下不同细胞周期下STAT1的胞内定位的胞内定位a.不同周期下STAT1蛋白水平变化b. 核内与胞质内STAT1蛋白数目比率变化c.蛋白免疫印迹检测STAT1蛋白水平26STAT1蛋白簇特征分析蛋白簇特征分析簇数目簇尺寸27小结小结在细胞周期各个阶段，整个细胞内都有STAT1的蛋白簇，推测为STAT1寡聚体或与其他家