海洋活性物质分离纯化-液相色谱

1、1 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。采用普通规格的固定相及流动相常压输送的液采用普通规格的固定相及流动相常压输送的液相色谱法则为经典液相柱色谱，其柱效低、而相色谱法则为经典液相柱色谱，其柱效低、而且一般不具备在线检测器，通常作为分离手段且一般不具备在线检测器，通常作为分离手段使用。使用。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，是以经典的液相柱色谱为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相改引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在线检测等手为高压输送，采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分离分析方法。该法具有分离段，

2、发展而成的分离分析方法。该法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。为高效液相色谱法。2 (1)柱内径柱内径，填充剂粒度，填充剂粒度、均匀性、均匀性，新，新型固定相的问世型固定相的问世 。 (2)柱长柱长，填充剂机械强度，填充剂机械强度，供液压力和，供液压力和进样压力进样压力，流动相流速，流动相流速（15ml/min）（78个峰个峰/10min）。）。 (3)采用光学原理的检测器采用光学原理的检测器。 3 (1)样品受限制少，对易分解、不容易气样品受限制少，对易分解、不容易气化、分子量大、高极性的有机物（化、分子量大、高极性的有

3、机物（7080%的的有机物）可用有机物）可用HPLC分析。分析。 (2)不用制备衍生物，减少了误差。不用制备衍生物，减少了误差。 (3)进样量大（进样量大（500800L），易制备。），易制备。 (4)分离效率降低。分离效率降低。4高效液相色谱仪及一般分离高效液相色谱仪及一般分离流程。流程。51、概念、概念 HPLC：以溶剂或某种溶液为流动：以溶剂或某种溶液为流动相，以装在柱子里的固体为固定相，用高相，以装在柱子里的固体为固定相，用高压输液泵将流动相压入柱子，使样品组分压输液泵将流动相压入柱子，使样品组分在柱子里进行分离的柱色谱法。在柱子里进行分离的柱色谱法。2、分类、分类 根据色谱柱所用填充

4、剂的不同，根据色谱柱所用填充剂的不同，HPLC分离原理有：吸附色谱，分配色谱分离原理有：吸附色谱，分配色谱, 键合相色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等。键合相色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等。6用液液分配色谱的机理来讨论高效液相色谱的普遍性问题。用液液分配色谱的机理来讨论高效液相色谱的普遍性问题。 色谱的分离过程色谱的分离过程( (见图见图7-2)7-2)。（。（a a）在装好填料的柱子中加）在装好填料的柱子中加上样品，然后用溶剂洗脱，样品中各组分（若有上样品，然后用溶剂洗脱，样品中各组分（若有A A、B B、C C三三个组分）的分子沿流动相流动方向移动。（个组分）的分子沿流动相流动方向移动。（b

5、b）和（）和（c c）表）表示组分的移动。（示组分的移动。（d d）表示经过一段时间的洗脱以后，）表示经过一段时间的洗脱以后，A A、B B、C C三个组分已经被分离开，不同组分在柱子中移动速度不同三个组分已经被分离开，不同组分在柱子中移动速度不同而得到了分离，也就是说不同的组分在柱子上存在而得到了分离，也就是说不同的组分在柱子上存在差速迁差速迁移移现象。现象。 另外，对照（另外，对照（a）和（）和（d）可以）可以发现刚上样后，溶质分子形成的发现刚上样后，溶质分子形成的色带（又叫谱带）较窄，而到了色带（又叫谱带）较窄，而到了（d）中，各组分的谱带明显变）中，各组分的谱带明显变宽，这说明同一组分

6、沿柱子移动宽，这说明同一组分沿柱子移动时，存在着扩散问题，即时，存在着扩散问题，即谱带的谱带的扩散。扩散。三三组分样品分离过组分样品分离过程示意图程示意图7 差速迁移差速迁移：不同组分在柱子中移动速度不同而使：不同组分在柱子中移动速度不同而使其混合物得到分离，即不同的组分在柱子上存在其混合物得到分离，即不同的组分在柱子上存在差速迁移现象。差速迁移现象。引起原因引起原因：在分配色谱中，由于：在分配色谱中，由于不同组分在固液两相的分配系数不同引起；在离不同组分在固液两相的分配系数不同引起；在离子交换色谱中，主要是由于各组分对固定相的静子交换色谱中，主要是由于各组分对固定相的静电引力不同造成的。电引

7、力不同造成的。 谱带扩展谱带扩展：同一组分沿色谱柱移动时，色带由窄：同一组分沿色谱柱移动时，色带由窄变宽，即同一组分在柱子上存在谱带扩展现象。变宽，即同一组分在柱子上存在谱带扩展现象。产生原因产生原因：由于同一个化合物的不同分子，在通：由于同一个化合物的不同分子，在通过柱子时平均迁移速度不同造成的。其原因是由过柱子时平均迁移速度不同造成的。其原因是由于涡流扩散和各种传质情况的差异造成了同一物于涡流扩散和各种传质情况的差异造成了同一物质不同分子的差速迁移。质不同分子的差速迁移。8 目前应用较多的有紫外吸收检测器、荧光检测目前应用较多的有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测器、蒸

8、发光散射器、电化学检测器、化学发光检测器、蒸发光散射检测器、安培检测器及示差折光检测器等。检测器、安培检测器及示差折光检测器等。 紫外检测器是紫外检测器是HPLC应用最普遍的检测器，利应用最普遍的检测器，利用紫外分光光度计的原理对各组分进行检测，属浓用紫外分光光度计的原理对各组分进行检测，属浓度型检测器。灵敏度、精密度及线性范围均较好。度型检测器。灵敏度、精密度及线性范围均较好。既用于等浓度，也用于梯度洗脱。既用于等浓度，也用于梯度洗脱。但但只能用于对紫只能用于对紫外线有吸收的组分的检测，且流动相的选择有一定外线有吸收的组分的检测，且流动相的选择有一定的局限性，其截止波长必须小于检测波长。的局

9、限性，其截止波长必须小于检测波长。9 荧光检测器利用荧光分光光度计的原理对荧光检测器利用荧光分光光度计的原理对各组分进行检测，其灵敏度高于紫外吸收检测各组分进行检测，其灵敏度高于紫外吸收检测器，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧器，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生光的物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。在用于氨基酸素、甾体化合物及酶等的检测。在用于氨基酸检测时，需用衍生法制备衍生物，其衍生法分检测时，需用衍生法制备衍生物，其衍生法分为柱前与柱后衍生两种，常用邻苯二甲醛或异为柱前与柱后衍生两种，常用邻苯二甲醛或异氰硫基苯为

10、衍生化试剂，是分析氨基酸应用最氰硫基苯为衍生化试剂，是分析氨基酸应用最广的方法。广的方法。 10 属于通用型检测器。其检测原理是液体属于通用型检测器。其检测原理是液体都有折光指数，很少有两种液体具有相同的都有折光指数，很少有两种液体具有相同的折光指数，所以折光指数，所以 化合物都可用这种检测器化合物都可用这种检测器检出。当流动相恒定地流过检测池时，其折检出。当流动相恒定地流过检测池时，其折光指数不变，仪器得到一条基本平直的基线。光指数不变，仪器得到一条基本平直的基线。当有组分峰当有组分峰流过检测流过检测池时，折光指数发生变池时，折光指数发生变化，记录仪记下这信号，即为色谱图。其缺化，记录仪记下

11、这信号，即为色谱图。其缺点：灵敏度较少低，检出下限为点：灵敏度较少低，检出下限为10-7g/mL10-7g/mL；易受温度和流速的影响；不能进行梯度洗脱易受温度和流速的影响；不能进行梯度洗脱。 11 蒸发光散射检测器是蒸发光散射检测器是20世纪世纪90年代出现年代出现的最新型通用检测器，可用于挥发性低于流的最新型通用检测器，可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的样品组分检测灵敏度较低，因而主要吸收的样品组分检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯

12、及甾体类等脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。几十类化合物。 12 这种检测器是示差折光检测器的理想替代这种检测器是示差折光检测器的理想替代品。其检测原理是：将流出色谱柱的流动相及品。其检测原理是：将流出色谱柱的流动相及组分先引入已通气体的蒸发室，加热，使流动组分先引入已通气体的蒸发室，加热，使流动相蒸发而除去；样品组分在蒸发室内形成气溶相蒸发而除去；样品组分在蒸发室内形成气溶胶，而后进入检测室；用强光或激光照射气溶胶，而后进入检测室；用强光或激光照射气溶胶产生光散射，测定散射光强而获得组分的浓胶产生光散射，测定散射光强而获得组分的浓度信号。度信号。13 化学发光检测器是近年来

13、发展起来的高选化学发光检测器是近年来发展起来的高选择性及高灵敏度的新型检测器，其设备简单，择性及高灵敏度的新型检测器，其设备简单，自身发光，不需光源，价格便宜，是一种有发自身发光，不需光源，价格便宜，是一种有发展前途的检测器，可用于药物代谢分析及免疫展前途的检测器，可用于药物代谢分析及免疫研究。其检测原理是：将流出色谱柱的组分与研究。其检测原理是：将流出色谱柱的组分与发光试剂混合，产生化学发光反应，光辐射可发光试剂混合，产生化学发光反应，光辐射可用光导纤维传输，由光电倍增管检测，从而获用光导纤维传输，由光电倍增管检测，从而获得信号。得信号。14几种主要检测器的基本特性几种主要检测器的基本特性

14、15 HPLCHPLC发展早期，其填料常用固体吸附剂作固定相，发展早期，其填料常用固体吸附剂作固定相，这种色谱叫液这种色谱叫液固吸附色谱；另一类填料常采用固吸附色谱；另一类填料常采用在固相载体上涂上一层固定液作为固定相（其代在固相载体上涂上一层固定液作为固定相（其代替物是键合填料），替物是键合填料）， 这种色谱是液这种色谱是液液分配色谱。液分配色谱。键合填料即将配基直接键合在固体基质上作为固键合填料即将配基直接键合在固体基质上作为固定相。反相色谱填料是其中之一。定相。反相色谱填料是其中之一。 所谓反相色谱或正相色谱，其叫法是根据填料和所谓反相色谱或正相色谱，其叫法是根据填料和流动相的相对极性来

15、区别。流动相的相对极性来区别。流动相极性弱于固定流动相极性弱于固定相的液相色谱法叫正相色谱。相的液相色谱法叫正相色谱。如以硅胶为吸附剂，如以硅胶为吸附剂，以有机溶剂为流动相的吸附色谱中，由于硅胶以有机溶剂为流动相的吸附色谱中，由于硅胶（SiOSiO2 2XHXH2 2O O）表面大量硅羟基的存在，其极性强）表面大量硅羟基的存在，其极性强于流动相，故是正相色谱。于流动相，故是正相色谱。流动相极性强于固定流动相极性强于固定相的液相色谱叫反相色谱。相的液相色谱叫反相色谱。如以有机溶剂加水作如以有机溶剂加水作流动相，以烷基、苯基键合相填料作固定相的色流动相，以烷基、苯基键合相填料作固定相的色谱就是反相

16、色谱。反相高效液相色谱是应用最广谱就是反相色谱。反相高效液相色谱是应用最广的一类高效液相色谱法。的一类高效液相色谱法。 16 由固体刚性基质和键合在基质上的配基组成。由固体刚性基质和键合在基质上的配基组成。 （1 1）基质（担体）：硅胶。其表面有大量深浅和孔径不同）基质（担体）：硅胶。其表面有大量深浅和孔径不同的孔隙，这样就使硅胶的表面积大大扩大了。一般常用孔的孔隙，这样就使硅胶的表面积大大扩大了。一般常用孔径在径在6-12nm6-12nm。（2 2）配基：配基都是不同类型的有机基团。采用直接键合的）配基：配基都是不同类型的有机基团。采用直接键合的方法固定到基质上。方法固定到基质上。 其方法：

17、通过有机氯硅烷与硅胶表面其方法：通过有机氯硅烷与硅胶表面硅羟基反应键合上去的。即：硅羟基反应键合上去的。即：= Si-OHOSi-OHOSi-OH=RSiCl3H2O= Si-OOSi-OOSi-OH=RSiCl= Si-OOSi-OOSi-OH=RSiOH= Si-OOSi-OOSi-O-Si(CH3)3=RSiO-Si(CH3)3(CH3)3SiCl硅胶基质 钝化剂(除去残余硅羟基)R为配基R(CH2)nCH3=(CH2)nCN=Arn=3717 此类键合相表面基团为非极性烃此类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基键合相（十八烷基键合硅胶，基，如十八烷基键合相（十八烷基键合硅胶，octa

18、decylsilane, ODS, C18）以及辛烷基（）以及辛烷基（C8）、）、乙基、甲基和苯基键合相。其中苯基可诱导极化，乙基、甲基和苯基键合相。其中苯基可诱导极化，所以也可视为弱极性键合相。所以也可视为弱极性键合相。 国内产品有国内产品有YWG-C18和和YWG-C8 和和YWG-C6H5，国外代，国外代表性产品有：表性产品有：Nucleosil C18，Spherisorb ODS-2，Zorbox- C8等。等。HPLC中中80%的分离工作所用的固定相都是的分离工作所用的固定相都是ODS ，流，流动相为不同比例的水和甲醇，所以是反相技术。为提高固定动相为不同比例的水和甲醇，所以是反相

19、技术。为提高固定相极性，可缩短烷基的链长度，选用相极性，可缩短烷基的链长度，选用YWG-C8为固定相。为固定相。YWG-C6H5为反相，用于分离芳香族化合物。为反相，用于分离芳香族化合物。 18 常见的中等极性键合相常见的中等极性键合相有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。国反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。国内 产 品 有内 产 品 有 Y W G - R O R ， 进 口 产 品 有， 进 口 产 品 有Permaphase-ETH。此类键合相应用较少。此类键合相应用较少。 常用的极性键合相有氨基、常用的

20、极性键合相有氨基、氰基键合相用。这种键合相既可作正相又可作氰基键合相用。这种键合相既可作正相又可作反相色谱的固定相。国内产品有反相色谱的固定相。国内产品有YWG-NH2、YWG-CN 和和YQG-NH2、YQG-CN ；进口产品；进口产品有有Nucleosil NH2或或CN ，Lichrosorb NH2或或Zorbox-CN。19 极性溶剂。常用：极性溶剂。常用：有机溶剂有机溶剂( (如甲醇、异丙醇、乙腈、二氧六环如甲醇、异丙醇、乙腈、二氧六环) )水水 在这些溶剂中，水的洗脱能力最弱。所以在反相在这些溶剂中，水的洗脱能力最弱。所以在反相色谱的梯度洗脱中，色谱的梯度洗脱中，A A液以水为主

21、，液以水为主，B B液以有机溶液以有机溶剂为主。洗脱过程中逐渐向流动相中添加有机溶剂为主。洗脱过程中逐渐向流动相中添加有机溶剂，就达到了逐渐增加洗脱强度的目的。相反，剂，就达到了逐渐增加洗脱强度的目的。相反，如果向水中添加无机盐，则是减弱了洗脱剂的强如果向水中添加无机盐，则是减弱了洗脱剂的强度，增强了样品组分在柱子上的保留。度，增强了样品组分在柱子上的保留。 RPCRPC中应用最广的流动相是中应用最广的流动相是: :水水甲醇甲醇 、水、水乙乙腈腈注：注：甲醇和乙腈一般用色谱纯，而水应当是二次蒸甲醇和乙腈一般用色谱纯，而水应当是二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理馏水或蒸馏水经脱离子处理20（两种模型

22、）（两种模型）一个分子有亲水部分和疏水部分两类基团。亲水一个分子有亲水部分和疏水部分两类基团。亲水基团如基团如OHOH、-NH-NH2 2、-COOH-COOH和和-SH-SH等极性官能团，等极性官能团，疏水基团如苯环疏水基团如苯环-CH-CH3 3、-CH-CH2 2- -等基团。等基团。当一个非极性溶质或分子中的非极性部分放入一当一个非极性溶质或分子中的非极性部分放入一个极性溶剂中时，这个非极性部分（即疏水性基个极性溶剂中时，这个非极性部分（即疏水性基团）与极性溶剂之间相互产生了一个斥力，分子团）与极性溶剂之间相互产生了一个斥力，分子中的非极性部分总是趋向于与其他非极性部分聚中的非极性部分

23、总是趋向于与其他非极性部分聚集，以减少与极性溶剂的接触面积，减小表面张集，以减少与极性溶剂的接触面积，减小表面张力，使体系能量最低。这种溶质分子的非极性表力，使体系能量最低。这种溶质分子的非极性表面区域在水中倾向于减小与极性溶剂的接触面积面区域在水中倾向于减小与极性溶剂的接触面积的效应叫做疏水作用或疏溶剂效应。的效应叫做疏水作用或疏溶剂效应。21 在在RPCRPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非中，有机水溶液作流动相，溶质在非极性的配基（烷基、苯基等）上的保留，极性的配基（烷基、苯基等）上的保留，就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基就是由于溶质中的疏水基团倾向于与配基结合而造成的。结合而造成的

24、。 溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越溶质中的疏水性越强，与配基的结合地越牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增牢。所以有机同系物中随着烷基链长的增加，其保留值也增大。加，其保留值也增大。22 样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当样品分子和固定相上的配基在流动相中都是溶剂化的。当样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，两者之间结合面上的溶剂化分子被间结合面上的溶剂化分子被“挤挤”走，进入流动相。被走，进入流动相。被“挤挤”走的溶剂分子有走的溶剂分子有Z Z个。当样品分子被洗脱下来时，样个。当样品分子被洗脱下来时，样品分子进入了

25、流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶品分子进入了流动相，样品分子与配基的接触面重新被溶剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是剂化，重新溶剂化所需的溶剂分子是Z Z个，与保留时被个，与保留时被“挤挤”走的溶剂分子相等。走的溶剂分子相等。 固定相 吸附解吸 固定相 样品样品Z个23计量置换模型的数学表达式为：计量置换模型的数学表达式为： lgK=lgI-ZlgDlgK=lgI-ZlgD0 0 式中式中KK为容量因子；为容量因子；lgIlgI为常数；为常数；Z Z为配基础与样为配基础与样品分子接触面在样品分子被保留时释放出来的溶品分子接触面在样品分子被保留时释放出来的溶剂分子数；剂分子数； DD0 0

26、为洗脱剂中强溶剂的浓度。为洗脱剂中强溶剂的浓度。 在反相色谱中，样品与配基靠疏水作用结合。而在反相色谱中，样品与配基靠疏水作用结合。而洗脱液如水洗脱液如水甲醇体系中，醇比水更容易使疏水甲醇体系中，醇比水更容易使疏水性配基和样品溶剂化，在保留与置换中，醇在起性配基和样品溶剂化，在保留与置换中，醇在起作用，所以上式中作用，所以上式中DD0 0 为甲醇浓度。当柱子、溶为甲醇浓度。当柱子、溶剂、样品分子、温度固定后，剂、样品分子、温度固定后，Z Z为常数。以为常数。以lgKlgK对对lgDlgD0 0 作图可得一条直线。通过此表达式，使作图可得一条直线。通过此表达式，使洗脱剂浓度与保留值建立了直线的关

27、系式。洗脱剂浓度与保留值建立了直线的关系式。24 当样品组分不是离子型化合物，优先选用反相色谱来进行当样品组分不是离子型化合物，优先选用反相色谱来进行分离。分离。RPCRPC体系选择顺序：首先选柱子再选流动相，然后再体系选择顺序：首先选柱子再选流动相，然后再考虑检测器、温度、洗脱方式、进样量等条件。考虑检测器、温度、洗脱方式、进样量等条件。 常选常选 ODSODS柱（其配基为十八烷基）。该柱子优点：疏水性柱（其配基为十八烷基）。该柱子优点：疏水性强，分离性能好，样品分子在柱内保留值大，应用面广。强，分离性能好，样品分子在柱内保留值大，应用面广。 另外：对于生物蛋白质（大分子量），一般用另外：对

28、于生物蛋白质（大分子量），一般用C C4 4-C-C8 8的填的填料柱；料柱； 含含-CN-CN或或-NO-NO2 2的化合物，一般用苯基型填料柱；的化合物，一般用苯基型填料柱；多糖、类固醇这样的强极性物质可以使用氨基柱、氰基柱。多糖、类固醇这样的强极性物质可以使用氨基柱、氰基柱。氨基柱的配基为氨基柱的配基为-RNH-RNH2 2，它可以在一定的条件下，分别当正，它可以在一定的条件下，分别当正相柱、反相柱和离子交换柱使用，是一种特殊的填料。相柱、反相柱和离子交换柱使用，是一种特殊的填料。 25 首选：甲醇水首选：甲醇水 体系体系 若纯甲醇的洗脱能力还不够强，则要添加或换用若纯甲醇的洗脱能力还不

29、够强，则要添加或换用其他洗脱能更强的溶剂。常用的溶剂洗脱能力强其他洗脱能更强的溶剂。常用的溶剂洗脱能力强弱的顺序为：弱的顺序为：水水 乙腈乙腈 甲醇甲醇 二氧六环二氧六环 四四氢呋喃氢呋喃 异丙醇异丙醇若物质有发色团有紫外吸收，用紫外检测器。检测若物质有发色团有紫外吸收，用紫外检测器。检测波长最常用波长最常用254nm254nm，因为此波长下灯源光度最强。，因为此波长下灯源光度最强。若样品组分无紫外吸收，则可选示差折光检测器。若样品组分无紫外吸收，则可选示差折光检测器。 rtrt总之，选择色谱条件是根据总之，选择色谱条件是根据“样品组分样品组分”确定的。确定的。26 利用离子交换剂作为固定相，

30、以适宜的溶利用离子交换剂作为固定相，以适宜的溶剂作为流动相，使被分离混合物中的各组分按剂作为流动相，使被分离混合物中的各组分按其离子交换亲和力的不同而得到分离。其离子交换亲和力的不同而得到分离。 离子交换剂是不溶性高分子化合物，其分离子交换剂是不溶性高分子化合物，其分子中含有解离性离子交换基团，当一定量的水子中含有解离性离子交换基团，当一定量的水溶液通过交换柱时，能与存在于溶液中的阳离溶液通过交换柱时，能与存在于溶液中的阳离子或阴离子物质起可逆的交换作用。子或阴离子物质起可逆的交换作用。27 阳离子阳离子交换树脂交换树脂强酸型强酸型 弱酸型弱酸型 PO3HCOOH,OCH2COOHC6H4OH

31、SO3H阴离子阴离子交换树脂交换树脂强碱型强碱型 弱碱型弱碱型 N(CH3)2XC2H4OHN(CH3)3X NR2NHRNH228 （SCX） 电离程度不受溶液电离程度不受溶液pH变化的影响，在变化的影响，在pH 114范围内均能进行离子交换反应。范围内均能进行离子交换反应。RSO3H + NaOH RSO3Na + H2ORSO3H + NaCl RSO3Na + HCl RSO3Na + KCl RSO3K + NaCl 氢型钠型29 聚苯乙烯强酸型树脂：聚苯乙烯强酸型树脂： 一般为黑褐色，是最常用的强酸型阳离子交换一般为黑褐色，是最常用的强酸型阳离子交换树脂，以苯乙烯为单位，向上下左右

32、延伸的网状结树脂，以苯乙烯为单位，向上下左右延伸的网状结构是它的母体。母体上连结许多构是它的母体。母体上连结许多SOSO3 3H H。CH2CHCH2CHCH2CHCH2SO3HSO3HSO3HCH2CHCH2CHCH2CHCH2SO3HSO3H30常见型号：国产树脂中强酸常见型号：国产树脂中强酸1 17 7（上海树脂厂（上海树脂厂#732#732）、强酸型）、强酸型#1#1（南开大学树脂厂）和国外（南开大学树脂厂）和国外产品产品Dowex50Dowex50、Amberlite IR-120Amberlite IR-120、Zeo Zeo Karb225Karb225、Zerolit225Ze

33、rolit225、wofatit Kwofatit K、Permutit Permutit Q Q、Iiwatit S100Iiwatit S100都属于这种。都属于这种。特性：这种树脂很稳定，使用得当，经过几百特性：这种树脂很稳定，使用得当，经过几百次交换，交换当量也改变不大。对各种试剂也次交换，交换当量也改变不大。对各种试剂也较稳定，如较长时间浸在较稳定，如较长时间浸在5%5%氢氧化钠、氢氧化钠、0.1%0.1%高高锰酸钾、过氧化氢水溶液、锰酸钾、过氧化氢水溶液、0.1M0.1M硝酸中也不会硝酸中也不会改变性能。不溶于水和一般有机溶剂，耐热性改变性能。不溶于水和一般有机溶剂，耐热性也比其他

34、树脂好，必要时可以在沸水浴上也比其他树脂好，必要时可以在沸水浴上l00l00左右处理。左右处理。 31酚磺酸型树脂酚磺酸型树脂 是在聚乙烯树脂出现以前就被广泛应用的强酸性树脂，是在聚乙烯树脂出现以前就被广泛应用的强酸性树脂，可以用对羟基苯磺酸和甲醛缩合而成。可以用对羟基苯磺酸和甲醛缩合而成。国产树脂中华东强酸阳国产树脂中华东强酸阳4242和国外产品和国外产品Amberlite IR-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、Zeo Karb215、wofatit K 、wofatit KS都属于这种。这种树脂一般为黑色，交换量比苯都属于这种。这种树脂一般为黑色，交换量比苯乙烯

35、树脂小，遇碱或氧化剂时，性能易变化。在不同乙烯树脂小，遇碱或氧化剂时，性能易变化。在不同pHpH的的碱性溶液中离子交换的作用不同，因为有以上缺点，故应碱性溶液中离子交换的作用不同，因为有以上缺点，故应用范围较小。用范围较小。 CH2CH2CH2OHCH2SO3HCH2OHCH2CH2OHOHCH2CH2OHSO3H32 (SAX) 电离程度不受溶液电离程度不受溶液pH变化的影响，在变化的影响，在pH 114范围内均能进行离子交换反应。范围内均能进行离子交换反应。羟型氯型RN+(CH3)3OH- + HCl RN+(CH3)3Cl- + H2O RN+(CH3)3OH- + NaCl RN+(C

36、H3)3Cl- + NaOH RN+(CH3)32SO42- + 2NaCl RN+(CH3)3Cl- + Na2SO4 33 树脂的母体和苯乙烯强酸性树脂相同，区别在于母树脂的母体和苯乙烯强酸性树脂相同，区别在于母体上连结有季铵。国产树脂中强碱性体上连结有季铵。国产树脂中强碱性201（南开大学树（南开大学树脂厂）、强碱性脂厂）、强碱性201 7（上海树脂厂（上海树脂厂717）和国外产品）和国外产品Nalcite SAR、Dowex1、Dowex2、Amberlite IRA-400、Ambertite lRA-410、Ambertite XE-98、PermutitS、PermutitS、L

37、ewatit M、Zerolit FF等都届于这种。等都届于这种。这种强碱性树脂对酸、碱和有机溶剂亦较稳定，但在浓这种强碱性树脂对酸、碱和有机溶剂亦较稳定，但在浓硝酸中不稳定。游离型（硝酸中不稳定。游离型（OH型）比盐型（型）比盐型（Cl型）的耐型）的耐热性差，超过热性差，超过40-45就不稳定，因此一般商品都是就不稳定，因此一般商品都是Cl型。型。 CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CH2N+(CH3)3CH2N+(CH3)3Cl-Cl-34 (WCX) COOH电离程度受溶液电离程度受溶液pH变化的影响变化的影响很大，其交换能力随溶液很大，其交换能力随溶液pH的下降而减少，的下

38、降而减少，在酸性溶液中几乎不发生交换反应。所以羧酸在酸性溶液中几乎不发生交换反应。所以羧酸阳离子树脂的交换反应必须在阳离子树脂的交换反应必须在pH7的溶液中的溶液中才能正常进行，对酸性更弱的酚羟基树脂，则才能正常进行，对酸性更弱的酚羟基树脂，则应在应在pH9的溶液中才能进行反应。的溶液中才能进行反应。 RCOOH + NaOH RCOONa + H2ORCOONa + KCl RCOOK + NaCl 35 含有含有 - COOH 的树脂，母体有芳香族和脂肪的树脂，母体有芳香族和脂肪族两种。脂肪族类型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯族两种。脂肪族类型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的较多。芳香族类型的

39、用二羟基苯酸和甲醛聚聚合的较多。芳香族类型的用二羟基苯酸和甲醛聚合的较多。国产树脂中弱酸合的较多。国产树脂中弱酸l0l l28（上海树脂厂（上海树脂厂#724）、弱酸性）、弱酸性#10l（南开大学树脂厂）和国外产（南开大学树脂厂）和国外产品品Ambertite IRC-50、Wofatit C、Zerolit 226都属都属于弱酸性阳离子交换树脂。于弱酸性阳离子交换树脂。 CHCHCH2CH2CCCH3CH2CH3CH2COOHCOOHCOOHCH2CH3CCH2CH2CHCH36 (WAX) 基团的电离能力弱，和弱酸型阳离子树脂基团的电离能力弱，和弱酸型阳离子树脂一样，电离程度受溶液一样，电

40、离程度受溶液pH变化的影响很大，变化的影响很大，其交换能力随溶液其交换能力随溶液pH的降低而增大，在碱性的降低而增大，在碱性溶液中几乎不发生交换反应。所以交换反应必溶液中几乎不发生交换反应。所以交换反应必须在须在pH7的溶液中才能正常进行。的溶液中才能正常进行。 RN+H3OH- + HCl RN+H3Cl- + H2O RN+H3Cl- + Na2SO4 RN+H32SO42- + 2NaCl 37 含有含有 -NH2，NH，等基团的阴离子交换树脂。国产树，等基团的阴离子交换树脂。国产树脂中弱碱脂中弱碱330（上海树脂厂（上海树脂厂# 701）、弱碱）、弱碱3112（上海树脂（上海树脂厂厂#

41、704）、华东弱碱阴）、华东弱碱阴32l、弱碱性、弱碱性# 301（南开大学树脂（南开大学树脂厂）、弱碱性厂）、弱碱性330（同（同1）和国外产品）和国外产品Ambertite IR4B、Wofatit M、wofatit N、LewatitM、Dowex3、Fermutit W等等都属于此种。其基本结构如下。含有都属于此种。其基本结构如下。含有-NH-基团的碱性较强，基团的碱性较强，含有含有NH2或或NH的碱性较弱。这种树脂有黄、橙、黑等的碱性较弱。这种树脂有黄、橙、黑等颜色。颜色。NHNHCH2NHNHCH2CH2CH2NHCH2CH2NHNHCH2NHNHCH2CH2NHNHCH238强

42、性和弱性离子交换树脂的区别：交换速度不一样：强酸和强碱性树脂交换快转型时体积变化不一样：强酸和强碱性树脂由游离型转为盐型时，体积变化小，水洗容易达到中性；弱酸和弱碱性树脂由游离型转为盐型时，体积显著变化，水洗不容易达到中性；但是强酸性树脂的由盐型转为游离型时需要大量的酸处理。39离子交换色谱法，在早期都采用高分子聚合物，离子交换色谱法，在早期都采用高分子聚合物，如苯乙烯二乙烯苯为基体的离子交换树脂作如苯乙烯二乙烯苯为基体的离子交换树脂作固定相。因这种固定相具有膨胀性、不耐压、固定相。因这种固定相具有膨胀性、不耐压、表面的微孔型结构影响传质速率，所以在高效表面的微孔型结构影响传质速率，所以在高效

43、液相离子交换色谱法中已被离子型键合相所代液相离子交换色谱法中已被离子型键合相所代替。替。40 最常见的离子型键合相是以薄壳型或全多最常见的离子型键合相是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面再经化学键合成各种孔微粒硅胶为载体，表面再经化学键合成各种离子交换基团。离子交换基团。 阴离子键合相常用强酸性磺阴离子键合相常用强酸性磺酸型（酸型（SO3H），而阳离子键合相常用强碱），而阳离子键合相常用强碱性季铵盐型（性季铵盐型（N+R3Cl-）。）。 国产的离子化学键合相有国产的离子化学键合相有YWG-SO3H、YWG-N+R3Cl-和和YSG-SO3H、YSG-N+R3Cl-。41填料的柱容量：可用交换

44、容量或吸附容量表示。填料的柱容量：可用交换容量或吸附容量表示。 用单位量的填料含有可交换基团的数量表示。其用单位量的填料含有可交换基团的数量表示。其单位：微摩尔单位：微摩尔/ /克（克（mol/g）或）或 微摩尔微摩尔/ /毫升毫升（mol/mL）。）。 在特定色谱条件（动态或静态）下，填料吸附某在特定色谱条件（动态或静态）下，填料吸附某样品组分的最大量。用样品组分的最大量。用mg/g、g/L或或mol/g、mol/mL表示。吸附量是可变的：其值随测定方表示。吸附量是可变的：其值随测定方法、流动相的成分和样品的变化而变化。法、流动相的成分和样品的变化而变化。42交换容量受溶液交换容量受溶液pH

45、pH值的影响很大，特别是弱离子值的影响很大，特别是弱离子交换色谱填料。因为它们的交换基团需要在一定交换色谱填料。因为它们的交换基团需要在一定的的 pHpH值条件下才能完全电离，故受值条件下才能完全电离，故受 pHpH值的影响值的影响更大。见图更大。见图7-37-3。图图7-3 PH值对交换容量的影响值对交换容量的影响43由图可知：由图可知：强阳离子交换色谱填料强阳离子交换色谱填料 pHpH 1 1时才有明显交换时才有明显交换容量，容量，pHpH大时，交换容量几乎不再变化；而弱阳大时，交换容量几乎不再变化；而弱阳离子交换色谱填料离子交换色谱填料pH pH 6 6时才有明显交换容量，时才有明显交换

46、容量，且且PHPH越大，交换容量越大。越大，交换容量越大。强阴离子交换色谱填料，强阴离子交换色谱填料，pH pH 1010时才能使用；时才能使用；而弱阴离子交换色谱填料，而弱阴离子交换色谱填料，pHpH8 8时才有明显交换时才有明显交换容量，且容量，且PHPH越小，交换容量越大。越小，交换容量越大。 由上可知，强阳和强阴离子交换色谱填料，具有由上可知，强阳和强阴离子交换色谱填料，具有比弱阳（阴）离子交换色谱填料更大的比弱阳（阴）离子交换色谱填料更大的pHpH值使用值使用范围，能适应较多的化合物在不同的范围，能适应较多的化合物在不同的 pHpH条件下进条件下进行分离或使用行分离或使用 pHpH梯

47、度进行洗脱，所以应用较广。梯度进行洗脱，所以应用较广。但是对于一些保留太强的样品，选用弱离子交换但是对于一些保留太强的样品，选用弱离子交换色谱填料更方便些。色谱填料更方便些。44起主要决定作用的：静电力起主要决定作用的：静电力 将交换基团和样品分子近似地看作为两个点电荷，将交换基团和样品分子近似地看作为两个点电荷，它们之间的作用力它们之间的作用力 F F 为：为： F=qF=q1 1q q2 2 / r/ r2 2 式中式中q q1 1、q q2 2分别为两个点电荷电量；分别为两个点电荷电量；为介质的为介质的介电常数；介电常数；r r为两点电荷之间的距离。为两点电荷之间的距离。 在在IECIE

48、C中，交换基团的大小及电荷在固定中，交换基团的大小及电荷在固定pHpH值条件值条件下是不发生变化的，所以样品组分与交换基团的下是不发生变化的，所以样品组分与交换基团的作用力作用力 F F 随样品组分的带电情况及作用距离的不随样品组分的带电情况及作用距离的不同而变化。正是这种各组分与交换基团之间有不同而变化。正是这种各组分与交换基团之间有不同的作用力而使它们得以分离。同的作用力而使它们得以分离。45 在离子交换色谱中，如果流动相的在离子交换色谱中，如果流动相的pH pH 值改变，就会改变值改变，就会改变样品分子的电离平衡，从而改变样品组分的带电情况，使样品分子的电离平衡，从而改变样品组分的带电情

49、况，使保留值发生变化。保留值发生变化。 在在阳阳IECIEC中，样品组分应该带有正电荷，多是由于样品分中，样品组分应该带有正电荷，多是由于样品分子中含有各种氨基形成的正电荷。离解平衡：子中含有各种氨基形成的正电荷。离解平衡： R-NHR+ H+ RN+H2R 而在而在阴阴IECIEC中，样品分子应该带负电荷，多是由于羧酸根中，样品分子应该带负电荷，多是由于羧酸根或其他酸根离解形成的负离子。离解平衡：或其他酸根离解形成的负离子。离解平衡： RCOOH R COO- + H+ 可见，在可见，在阳阳IECIEC中，中，当当pHpH值减小值减小时时( (即即H H+ +浓度增大浓度增大) )，促使，促

50、使样品组分形成更多的正电荷。这会使样品组分对阳离子交样品组分形成更多的正电荷。这会使样品组分对阳离子交换剂表面带负电的交换基团亲合力增加，换剂表面带负电的交换基团亲合力增加，使保留值增加使保留值增加。 在在阴阴IECIEC中，中，当当pHpH值增大时值增大时( H( H+ +浓度减小浓度减小) )，促使样品组分，促使样品组分上酸根的离解，形成更多的负电荷，因而使样品组分对阴上酸根的离解，形成更多的负电荷，因而使样品组分对阴离子交换剂表面带正电的交换基团亲合力增加，离子交换剂表面带正电的交换基团亲合力增加，使保留值使保留值增加增加。 46当样品为蛋白质时，分析蛋白质在阴、阳离子交换色谱当样品为蛋

51、白质时，分析蛋白质在阴、阳离子交换色谱中，中，PH值改变对保留值影响。值改变对保留值影响。在选择弱阴、阳离子交换填料时，既要考虑填料在一定在选择弱阴、阳离子交换填料时，既要考虑填料在一定PHPH值下的离解度（值下的离解度（PHPH越小：越小：WAXWAX离解度越大，离解度越大，WCXWCX离解度越离解度越小），又要考虑在一定小），又要考虑在一定PHPH值下流动相的保留值（值下流动相的保留值（PHPH越小：阳越小：阳IECIEC中保留越小，阴中保留越小，阴IECIEC中，保留越大）。这两个是矛盾的。中，保留越大）。这两个是矛盾的。在选择条件时要注意，特别是流动相在选择条件时要注意，特别是流动相P

52、HPH的确定。的确定。H+H+OH-OH-阴离子阳离子两性离子PH=PI（等电点）PHPIPHPI在阴I EC中，流动相须PHPI,且越大，蛋白质保留越大。（ 负离子增多）蛋白质不保留Pr NH2COO-Pr NH3+COO-Pr NH3+COOH在阳I EC中，流动相须PHPI,且越小，蛋白质保留越大。（ 形成正离子更多）47蛋白质蛋白质的保留值的保留值( () )与其表面与其表面纯电荷纯电荷( () )及流动相及流动相PHPH的关系示意图的关系示意图48样品在溶液中能形成离子，则首选离子交换色谱。样品在溶液中能形成离子，则首选离子交换色谱。离子交换色谱的柱子的选择比其他色谱法更复杂。因为交

53、换离子交换色谱的柱子的选择比其他色谱法更复杂。因为交换基团有四种类型。样品的离解也有不同方式，所以要根据基团有四种类型。样品的离解也有不同方式，所以要根据样品和实验室条件选择适用的柱子。选择柱子时可遵循下样品和实验室条件选择适用的柱子。选择柱子时可遵循下列原则：列原则：定性、定量还是分离。定性、定量还是分离。分析型柱子：内径分析型柱子：内径4 48mm,8mm,长度长度5 525cm,25cm,流速流速0.5-3ml/min0.5-3ml/min。( (定性、定量用硬基质填料定性、定量用硬基质填料) )分离可以用高分子球基质。分离可以用高分子球基质。49 含有各种氨基（含有各种氨基（-RNH2

54、-RNH2，-NHR-NHR，-NR2-NR2）的组分，可）的组分，可在溶液中接受质子，形成正离子，所以要用阳离在溶液中接受质子，形成正离子，所以要用阳离子交换色谱柱子分离。子交换色谱柱子分离。 含有各种羧基的化合物，可以在溶液中放出质子，含有各种羧基的化合物，可以在溶液中放出质子，形成负离子，所以要用阴离子交换色谱填料。形成负离子，所以要用阴离子交换色谱填料。 等电点等电点PIPI值大的蛋白质，易形成阳离子，可优先值大的蛋白质，易形成阳离子，可优先选用阳离子交换色谱；等电点选用阳离子交换色谱；等电点PIPI值小的蛋白质，值小的蛋白质，易形成负离子，可优先选用阴离子交换色谱。易形成负离子，可优

55、先选用阴离子交换色谱。 50 一般小分子，选一般填料。而蛋白质等分子量一般小分子，选一般填料。而蛋白质等分子量很大的化合物，选用大孔径填料很大的化合物，选用大孔径填料( (常用内孔径在常用内孔径在25-50nm)25-50nm)。 盐水盐水 组成的溶液。组成的溶液。（盐溶于水以后形成的离子（盐溶于水以后形成的离子作为样品组分的顶替离子）作为样品组分的顶替离子） 洗脱强度：由顶替离子的浓度定。浓度越大，洗洗脱强度：由顶替离子的浓度定。浓度越大，洗脱能力越强。脱能力越强。 对样品及仪器无损害。例：对样品及仪器无损害。例：NaCl作为流动相时，作为流动相时，Cl对不锈钢有腐蚀性，要控制使用。对不锈钢

56、有腐蚀性，要控制使用。51对样品溶解度无影响。所以常用具有缓冲作用对样品溶解度无影响。所以常用具有缓冲作用的盐的盐梯度洗脱：盐浓度由弱梯度洗脱：盐浓度由弱强。改变洗脱强度可强。改变洗脱强度可以浓度梯度或以浓度梯度或PHPH梯度。梯度。 参见反相色谱部分。参见反相色谱部分。 操作温度一般选用室温，操作温度一般选用室温， 52交换溶液中氢离子的浓度显著增高时，交换溶液中氢离子的浓度显著增高时，会抑制阳离子交换基团的电离和目标离会抑制阳离子交换基团的电离和目标离子的交换反应。通常强酸性交换剂交换子的交换反应。通常强酸性交换剂交换液的液的pHpH应大于应大于2 2。弱酸性交换剂的交换。弱酸性交换剂的交

57、换液液pHpH应在应在6 6以上。以上。同样在阴离子交换剂中，强碱性交换剂同样在阴离子交换剂中，强碱性交换剂的交换液的的交换液的pHpH应在应在1212以下，弱碱性应在以下，弱碱性应在7 7以下。以下。53 主要取决于母体化合物的解离、目标离主要取决于母体化合物的解离、目标离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大，酸碱性强者置换容易，但洗脱相对来说大，酸碱性强者置换容易，但洗脱相对来说较难。离解离子价数愈高，电荷愈大，则它较难。离解离子价数愈高，电荷愈大，则它的引力愈强，愈易交换在交换树脂上。碱金的引力愈强，愈易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元

58、素还与它们的原子序属、碱土金属及稀土元素还与它们的原子序数有关，碱金属原子序数大，则交换吸附就数有关，碱金属原子序数大，则交换吸附就强，稀土元素的原子序数小，其交换吸附强。强，稀土元素的原子序数小，其交换吸附强。54 离子交换操作通常是在水溶液或含有离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶剂中进行，这样有利于离解与水的极性溶剂中进行，这样有利于离解与交换。交换。浓度越低，离子交换剂的选择性大。浓度越低，离子交换剂的选择性大。浓度过高，将降低物质的解离，有时会影浓度过高，将降低物质的解离，有时会影响吸附次序及选择性。另外，还会引起树响吸附次序及选择性。另外，还会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，

59、影响离子进脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。所以一般实验操作时所用溶液的入网孔。所以一般实验操作时所用溶液的浓度应该略稀，有利于提取分离。浓度应该略稀，有利于提取分离。55 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在但在0.1mol/L0.1mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。对弱酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可一般温度

60、增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。度的条件，避免引起交换剂的破坏。 通常在水中进行交换，通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行或不进行交换，同时还导致性小的溶剂中难以进行或不进行交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。离子交换的选择性的降低或消失。 56阳离子交换树脂临界温度阴离子交换树脂临界温度华东强酸阳42华东强酸阳42Na型95H型40华东弱碱阴32150Amberlite IR-120 Na型120H型100A