生物化学核酸杂交

1、会计学1生物化学核酸杂交生物化学核酸杂交核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理第一节第一节 核酸变性核酸变性 核酸复性核酸复性 核酸杂交核酸杂交 在化学和物理因素的影响下在化学和物理因素的影响下, ,维系核酸二维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA,DNA双双螺旋解旋成为单链的过程螺旋解旋成为单链的过程. . DNA DNA变性后，理化性质和生物活性丧失。变性后，理化性质和生物活性丧失。一、一、核酸的变性核酸的变性(denaturation) 物理因素物理因素：热（高温）：热（高温） 化学因素化学因素：酸、碱；：酸、碱； 变性剂（如尿素、胍）；

2、变性剂（如尿素、胍）； 有机溶剂（如乙醇、丙酮）有机溶剂（如乙醇、丙酮） （一）引起核酸变性的因素：（一）引起核酸变性的因素：（二）变性温度（或解链温度，（二）变性温度（或解链温度，Tm):Tm):单链单链DNADNA的紫外吸收比双链的紫外吸收比双链DNADNA高高40%40%，所以，所以变性导致变性导致DNADNA的紫外吸收增加，称为的紫外吸收增加，称为增色效增色效应（应（hyperchromic effecthyperchromic effect）。在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为旋被解开一半时的温度称为解链温度解链温度(

3、Tm)(Tm)。 （1）碱基组成：碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)% （2 2）分子大小）分子大小: : （3）离子强度：离子强度： （3）pH：59 （4）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的 形成，降低形成，降低TmTm值。值。（三）影响（三）影响TmTm值的因素：值的因素：变性的变性的DNADNA两条互补单链两条互补单链, ,在适当条件下重新在适当条件下重新缔合成双链的过程，又叫缔合成双链的过程，又叫退火退火。二、二、核酸的复性核酸的复性(renaturation)DNADNA复性后，理化性质和部分生物活性恢复。复性后，理化性质和部分生物活性恢复。 复

4、性导致复性导致DNADNA的紫外吸收降低，称为的紫外吸收降低，称为减色效应减色效应（hypochromic effecthypochromic effect）。DNADNA的最适复性温度（的最适复性温度（T Toror）比解链温度低）比解链温度低2020 -25-25（1 1）DNADNA大小：片段越小，复性越快；大小：片段越小，复性越快； 反之亦然。反之亦然。（2 2）离子强度：增加盐浓度可加速复性。）离子强度：增加盐浓度可加速复性。（3 3）DNADNA浓度：浓度越大，复性越快。浓度：浓度越大，复性越快。（4 4）若变性不彻底，复性很快。）若变性不彻底，复性很快。（5 5）序列越简单，复性

5、越快。）序列越简单，复性越快。影响复性速度的因素影响复性速度的因素DNADNA的变性和复性的变性和复性三、核酸分子杂交三、核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNADNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNADNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNADNA与与RNARNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNADNA或或RNARNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间关系，就可以在不同的分子之间形成形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)(heterodup

6、lex) 。 杂交可以发生在杂交可以发生在 DNA/DNADNA/DNA、DNA/RNADNA/RNA、 RNA/RNARNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与、以及人工合成的寡核苷酸单链与 DNADNA或或RNARNA之间。之间。分子基础：分子基础：核酸的变性和复性核酸的变性和复性杂交可分为：杂交可分为：液相杂交和固相杂交液相杂交和固相杂交复性复性RNADNA核酸分子杂交核酸分子杂交 第二节第二节 核核 酸酸 探探 针针 探针的概念探针的概念 探针的种类和选择探针的种类和选择 探针的标记探针的标记一、探针一、探针(probe)的概念的概念一小段用染料一小段用染料(同位素、生物素或荧光同位

7、素、生物素或荧光)标标记记的的(末端或全链末端或全链)已知序列已知序列的多聚核苷酸，的多聚核苷酸，与固定在膜与固定在膜(NC、PVDF或尼龙）上的核苷酸或尼龙）上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 简言之，简言之，探针指探针指已知序列已知序列的的标记核酸标记核酸片片段段。 二、探针二、探针(probe)的种类的种类n基因组基因组DNADNA探针探针ncDNAcDNA探针探针nRNARNA探针探针n人工合成的寡核苷酸探针（人工合成的寡核苷酸探针（ASOASO）探针种类探针种类三、探针的标记物三、探针的标记物（一）放射性同位素标记物：（一）放射性同位素

8、标记物： 32P、 3H、 35S 生物素（生物素（biotin） 地高辛（地高辛（digoxigenin ） 荧光素（荧光素（ fluorescein ） 酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）（二）非放射性标记物：（二）非放射性标记物：四、探针的标记方法四、探针的标记方法 酶标记法酶标记法 化学标记法化学标记法 体外标记方法：体外标记方法： n 切口平移法（切口平移法（nick translation)nick translation)n 随机引物法随机引物法 （random primingrandom priming）n DNADNA的的5 5末端标记末端标记n

9、 PCRPCR标记法标记法 几种探针标记方法：几种探针标记方法： 第三节第三节 印迹杂交技术印迹杂交技术以以固相杂交固相杂交为基础为基础. . 印迹杂交技术印迹杂交技术是将通过凝胶电泳分离的待测是将通过凝胶电泳分离的待测核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针进行杂交并分析。进行杂交并分析。印迹印迹指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。 样品制备样品制备 电泳分离电泳分离 预杂交预杂交 洗膜洗膜 分析分析杂交杂交 印迹印迹第四节第四节 常用核酸分子杂交技术常用核酸分子杂交技术 u DNADNA印迹法印迹法u RNARNA

10、印迹法印迹法u 斑点杂交法斑点杂交法u 原位杂交原位杂交 主要用于基因组主要用于基因组DNADNA的定性和定量分析的定性和定量分析( (特定序列特定序列定位定位) )，亦可分析重组质粒和噬菌体。，亦可分析重组质粒和噬菌体。一、一、 DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。埃德温迈勒萨瑟恩方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的性内切酶消化的DNA片段，将胶上的片段，将胶上的DNA变性并在原

11、位将单链变性并在原位将单链DNA片段转移片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，通过显色，检测的标记探针进行杂交，通过显色，检测特定特定DNA分子的含量。分子的含量。 两个主要过程：两个主要过程：一是印迹（一是印迹（blottingblotting）二是分子杂交二是分子杂交主要步骤主要步骤: : RE RE酶切待测酶切待测DNA DNA 琼脂糖电泳分离待测琼脂糖电泳分离待测DNADNA片段片段 使使DNADNA变性变性 中和中和 预杂交预杂交 杂交杂交 放射自显影放射自显

12、影 结果分析结果分析一、一、 DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) DNA的纯化、酶切的纯化、酶切凝胶电泳分离凝胶电泳分离DNA片段片段DNA变性变性转膜、固定转膜、固定预杂交、杂交预杂交、杂交检测检测分析分析制备探针制备探针 Southern blotting 的步骤：的步骤：DNA分子杂交实验分子杂交实验目目 录录放放射射自自显显影影照照片片 将将RNARNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探针进行杂交。针进行杂交。二二 、RNA印迹技术印迹技

13、术 (Northern blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析。主要用于检测某一的定性定量分析。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异组织或细胞中已知的特异mRNAmRNA的表达水平，也可以的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。 Northern blotting 的步骤的步骤制备探针制备探针变性、凝胶电泳变性、凝胶电泳泡胶，洗去变性剂泡胶，洗去变性剂转膜、固定转膜、固定预杂交、杂交预杂交、杂交检测检测分析分析RNA的纯化的纯化与与DNADNA印迹的区别：印迹的区别： DNADNA印迹是先电泳后变性、转移；印迹是先

14、电泳后变性、转移； RNARNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能印迹是先变性后电泳、转移，且不能 采用碱变性采用碱变性固定固定直接将样品点在膜上直接将样品点在膜上预杂交、杂交预杂交、杂交检测检测分析分析制备探针制备探针三、斑点杂交法三、斑点杂交法(dot blotting) 特点特点: 简单简单, ,但特异性差但特异性差. . 在细胞保持基本形态的情况下将探针在细胞保持基本形态的情况下将探针注入细胞内与注入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交，杂交反应在杂交，杂交反应在载物片上的细胞内进行。载物片上的细胞内进行。 四、原位杂交法四、原位杂交法(in situ hybridization)D

15、NA点阵点阵44 物理因素物理因素：热（高温）：热（高温） 化学因素化学因素：酸、碱；：酸、碱； 变性剂（如尿素、胍）；变性剂（如尿素、胍）； 有机溶剂（如乙醇、丙酮）有机溶剂（如乙醇、丙酮） （一）引起核酸变性的因素：（一）引起核酸变性的因素：变性的变性的DNADNA两条互补单链两条互补单链, ,在适当条件下重新在适当条件下重新缔合成双链的过程，又叫缔合成双链的过程，又叫退火退火。二、二、核酸的复性核酸的复性(renaturation)DNADNA复性后，理化性质和部分生物活性恢复。复性后，理化性质和部分生物活性恢复。 杂交可以发生在杂交可以发生在 DNA/DNADNA/DNA、DNA/RN

16、ADNA/RNA、 RNA/RNARNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与、以及人工合成的寡核苷酸单链与 DNADNA或或RNARNA之间。之间。分子基础：分子基础：核酸的变性和复性核酸的变性和复性杂交可分为：杂交可分为：液相杂交和固相杂交液相杂交和固相杂交 探针的概念探针的概念 探针的种类和选择探针的种类和选择 探针的标记探针的标记u DNADNA印迹法印迹法u RNARNA印迹法印迹法u 斑点杂交法斑点杂交法u 原位杂交原位杂交 主要用于基因组主要用于基因组DNADNA的定性和定量分析的定性和定量分析( (特定序列特定序列定位定位) )，亦可分析重组质粒和噬菌体。，亦可分析重组质粒和噬菌体。一、一、 DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mel