第四次分生讨论课问题四整合课件

1、 主要分以下几个方面进行阐述 （1）对资料gene bank 中的基因的分析 （2）cDNA的获取 （3）cDNA的扩增 （4）cDNA后续处理以下是查找到的全长基因序列 利用利用TRIZOL 发抽提雌性小鼠的卵细胞中的所有发抽提雌性小鼠的卵细胞中的所有RNA得到得到以下图示结果：以下图示结果： 5m7Gppp - AAA 3(抽提的抽提的mRNA）5m7Gppp - AAA 3 （mRNA） - （cDNA）5m7Gppp - AAA 3 （mRNA） - TTT （cDNA） -AAA3 -TTT5RNase H DNA-pol 缓冲液缓冲液 首先我们必须得设计好引物，本次实验的目的是扩增

2、出133-1941位中的核苷酸链。因此在扩增之前必须得先设计primer 设计引物的方法： 走 以下是设计引物的一个过程： -3 5- forward primer Reverse primer -3 -5 获得高浓度的cDNA分子之后，由于末端扩增出的片段与表达载体并不匹配，因此为了更好的进行表达载体的构建，因此我们还需要对获得懂得cDNA进行后续的处理。 以下为扩增后的cDNA分子处理： -AAA3 -TTT5 -AAA3 -TTT5修齐末端37 10min目的基因导入受体细胞植物的遗传转化转基因动物技术植物遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通

3、道法转基因动物 （受精卵原核）显微注射法 迄今较为普遍最有成效（小鼠、绵羊、猪、大鼠、兔、牛、鱼.）导入的外源基因片段可长达导入的外源基因片段可长达50kp，且无需载体。且无需载体。难以控制整合率，检测必须等难以控制整合率，检测必须等到子代出生。到子代出生。逆转录病毒感染法 (小鼠、家禽)逆转录病毒核酸 单链RNA 反转录酶 反转录 细胞核基因组 双链DNA 整合率高 100% 逆转录病毒载体对于多细胞转化的优越性（培育转基因禽类研究中有广泛应用，目前制备转基因禽类最有效和最成功的方法） 只能转移小片段DNA(10kb) 潜在的致癌性重组重组整合整合胚胎干细胞（Embryonic stem c

4、ells）法 外源基因直接导入ES细胞筛选、富集被转染的细胞注入受体囊胚腔移入假孕个体获得转基因动物能在细胞水平进行筛选和确定性别能随机整合和同源重组整合 基因打靶能加入、剔除或替换某个基因（小到一个或几个核苷酸）目前ES细胞仅在小鼠、鸡和人的早期胚胎中分离出来ES细胞的培养条件苛刻、技术要求高,成本大目的基因的筛选与鉴定 制作人-莫思凡 目的：筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 首先：筛选出带有载体的克隆 其次：筛选出带有重组体的克隆 最后：筛选出带有特异DNA序列的克隆 方法： 遗传学方法 核酸杂交法 酶切鉴定 PCR技术 免疫学方法 遗传学方法 （一）抗药性标记插入失活筛选法（插入灭

5、活法） 在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。载体常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）。 （二）-半乳糖苷酶显色反应筛选法（-互补） -半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源检测外源DNADNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。插入作用的一种通用方法是插入失活效应。1.1.以真核表达载体为例以真核表达载体为例（1 1）真核表达载体真核表达载体应具有的特性应具有的特性 在真核表达载体上有两个

6、抗生素基因，Ampr基因内有一个Pst限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamH和Sal两种限制性核酸内切酶单一识别位点。（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插入失活筛选法1.1.以真核表达载体为例以真核表达载体为例（2 2）筛选重组体的原理筛选重组体的原理 在在Ampr和和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基基因因或或Tetr基因基因出现功能性出现功能性失活失活，于是，所形成的重组质粒都将具有，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或或Amprtets的表型。的表型。 当当外源外源DNADNA片段插入片段插

7、入真核表达载体真核表达载体DNADNA的的BamH或或Sal位点时，位点时，抗四抗四环素基因失活环素基因失活（Tetr Tets ），重组体转化子必定具有），重组体转化子必定具有AmprTets表型表型。因此，。因此，将转化菌先涂布在含有将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上的琼脂平板上，并将存活的，并将存活的Ampr菌落菌落原位影印原位影印到另一个含有到另一个含有Tet的琼脂平板上的琼脂平板上，凡是在，凡是在Amp平板上生长平板上生长，而，而不在不在Tet平板上平板上生长的菌落生长的菌落，就，就必定是必定是已经插入了外源已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆片段的重组质粒转化子克隆.

8、.如下图所示如下图所示同样同样, ,在真核表达载体的在真核表达载体的AmpAmpr r基因序列中基因序列中, ,利用利用PstPst限制性核酸内切酶识别位点限制性核酸内切酶识别位点, ,插入外源插入外源DNADNA片段片段, ,也也能应用插入失活作用检测重组质粒能应用插入失活作用检测重组质粒, ,当然当然, ,所挑选所挑选的菌落就应该是具有的菌落就应该是具有AmpAmps sTetTetr r的表型的表型（一）抗药性标记插入失活筛选法（一）抗药性标记插入失活筛选法载体载体载体AmprTetrAmprTetrAmprTets+ +菌落原位影印菌落原位影印Amp琼脂平板琼脂平板Tet琼脂平板琼脂平

9、板图图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法1.1.乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构阻遏蛋白阻遏蛋白- -半乳半乳糖苷酶糖苷酶- -半半乳糖苷乳糖苷透过酶透过酶- -半乳糖半乳糖苷乙酰基苷乙酰基转移酶转移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚聚合酶合酶（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法2.2.- -半乳糖苷酶显色反应筛选法原理半乳糖苷酶显色反应筛选法原理 有许多质粒载体具有有许多质粒载体具有- -半乳糖苷酶显色反应的检测功

10、能半乳糖苷酶显色反应的检测功能. . 应用这些载体系列，当外源应用这些载体系列，当外源DNADNA插入插入到它的到它的lacZlacZ基因基因上时，上时，可造成可造成- -半乳糖苷酶的失活效应半乳糖苷酶的失活效应，就可通过大肠杆菌转化子菌，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加落在添加X-gal-IPTGX-gal-IPTG培养基中的培养基中的颜色变化颜色变化鉴别出重组子和非重鉴别出重组子和非重组子。组子。（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法3.3.举例举例 pUC质粒质粒：带有：带有- -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列）的调控序列和和- -半乳糖

11、苷酶半乳糖苷酶N N端端146个氨基酸的编码序列个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并一识别位点的多克隆位点，但并没有破坏没有破坏lacZ的阅读框架。的阅读框架。 大肠杆菌菌株：大肠杆菌菌株：带有带有- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。端部分序列的编码信息。 在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的质粒和大肠杆菌编码的- -半乳半乳糖苷酶片段都没有活性。糖苷酶片段都没有活性。（二）（二）- -半乳糖苷酶显色反应筛选法半乳糖苷酶显色反应筛选法3. 3. 举例举例 当

12、质粒转化大肠杆菌后当质粒转化大肠杆菌后, ,可形成可形成具有酶活性具有酶活性的蛋白质的蛋白质, ,它在生色底物它在生色底物X-gal的存在下被的存在下被IPTG( (异丙基异丙基- -D-D-硫代半乳糖苷）诱导形成硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落蓝色菌落。当外。当外源片段源片段插入插入到到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变读码框架改变，表达蛋，表达蛋白白失活失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成形成白色菌落白色菌落。因此，根据这种。因此，根据这种- -半乳糖苷酶的

13、显色反应，可将重组质粒半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体与自身环化的载体DNADNA分开。分开。将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性酸纤维膜上变性 带有目的基因的放射性带有目的基因的放射性DNADNA或或cDNAcDNA作探针进行杂交作探针进行杂交放射性自显影放射性自显影 杂交信号（杂交信号（黑点）黑点）对应的噬菌斑对应的噬菌斑即为阳性即为阳性克隆克隆。核酸分子杂交检测法（1 1）菌落印迹原位杂交）菌落印迹原位杂交 菌落印迹原位杂交的菌落印迹原位杂交的优点优点是：适于是：适于高密度高密度菌落的筛选菌落的筛选, ,对对于噬菌斑平板于噬菌斑

14、平板, ,它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜, ,获得获得数张同样的数张同样的DNA印迹。因此，能够进行印迹。因此，能够进行重复筛选重复筛选，效率高效率高，可可靠性强靠性强，而且可以连续使用，而且可以连续使用两种两种或或数种探针数种探针筛选筛选同一套同一套重组体重组体DNADNA，是一种最常规的检测手段。，是一种最常规的检测手段。(2) (2) 核酸分子杂交：核酸分子杂交：.Southern.Southern杂交分析：杂交分析：由英由英国国SouthernSouthern（19751975）发明，）发明，将琼将琼脂糖中脂糖中DNADNA转移到转移到尼龙膜尼

15、龙膜进行进行DNADNA分子杂交分子杂交分析的方法。分析的方法。筛选基因库得到筛选基因库得到阳性克隆阳性克隆将限制性酶酶切与将限制性酶酶切与SouthernSouthern杂交杂交结合结合绘制限制性酶图谱绘制限制性酶图谱。.Northern.Northern杂交分析：杂交分析： 与与SorthernSorthern杂交的原理和杂交的原理和程序相同。程序相同。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，平，检测检测mRNAmRNA的存在的存在。 物理检测法(酶切鉴定)重组质粒的快速提取与酶切鉴定重组质粒的快速提取与酶切鉴定 经过遗传筛选得到的阳性克隆还

16、必须进一步进行鉴定，经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行鉴定，酶酶切鉴定切鉴定是最常用的方法之一。是最常用的方法之一。 通过提取通过提取“阳性克隆阳性克隆”的质粒，酶切分析的质粒，酶切分析“阳性克隆阳性克隆”中中质粒的质粒的大小大小和和酶切图谱酶切图谱，通过这种方法鉴定载体中是否含有外，通过这种方法鉴定载体中是否含有外源源DNADNA片段，载体中是否含有正确的目的片段，载体中是否含有正确的目的DNADNA片段。这种方法判片段。这种方法判断的断的标准标准是目的是目的DNADNA分子和载体的分子大小及酶切图谱。分子和载体的分子大小及酶切图谱。Mr12345678910Mr:DNA分子分子Marker; ;1 1: :目的目的DNA片段片段; ;2 2: :目的目的DNA片段片段EcoR酶切酶切; ;3 3: :空载体空载体EcoR酶切酶切; ;4-104-10: :为不同为不同”阳性克隆阳性克隆”质粒的质粒的Ec