第13章、生物活性测定技术

1、生物活性分子的分离与表征第10章、电泳技术第11章、定量分析技术第12章、组分分析技术第第1313章、生物活性测定技术章、生物活性测定技术第第13章、生物活性测定技术章、生物活性测定技术13.1、概述13.2、酶最适反应条件的测定13.3、酶动力学参数的测定13.4、酶促反应的影响因素13.5、实例 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。 要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测

2、要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测定方法。定方法。 酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 13.1、概述一、酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个酶活性单位

3、。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制剂所含的酶活性单位来表示，即剂所含的酶活性单位来表示，即u/ml。对于固体状。对于固体状态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的酶活性单位来表示，即酶活性单位来表示，即u/mg。国际酶活性单位 1961 1961年，国际酶学会议为酶活性单位规年，国际酶学会议为酶活性单位规定了一个统一的标准，即在特定的条件下定了一个统一的标准，即在特定的条件下（一般为酶催化反应的最适条件），（一般为酶催化反应的最适条件），1 1分钟转分钟转化化1mol1mol底物，或转化底物，或转化1N

4、1N底物有关基团所底物有关基团所需的酶量为需的酶量为1 1个国际单位（个国际单位（IUIU）。）。比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。的纯度越高。二、酶活性测定的主要方法 温度、温度、pH、离子强度（、离子强度（I=(1/2)CZ2）等因）等因素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采素对酶活性有很大的影

5、响，测定酶活性时一般采用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子，用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子，应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度，速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度，即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应即反应开始后较短一段时间内的

6、反应速度（反应了的底物不超过了的底物不超过5%）。）。 1 1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸还原酶将硝酸还原酶将NO3 还原成还原成NO2，NO2 与加与加入的显色剂对氨基苯磺酸和入的显色剂对氨基苯磺酸和萘胺反应生成玫萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以的生成量。一些脱氢酶以NAD+或或NADP+为辅酶，为辅酶，NAD+或或NADP+在在340nm处光吸收很少，而其还原处光吸收很少，而其还原形式形式NADH和和NADPH在在340nm处光吸收较大，因处光吸收较大，因此可以测定此可以测

7、定340nm处的光吸收变化来检测处的光吸收变化来检测NADH和和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。乳酸脱氢酶催化的反应乳酸脱氢酶催化的反应乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶2 2 旋光测定旋光测定法（法（polarimetrypolarimetry） 若底物和产物的旋光性不同，可通过若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。变化来测定酶活性。3 3 荧光荧光法（法（fluorescencefluorescence） 氧化态的黄氧化态的黄素（素（flavin）化合物发出强）化合物发出

8、强烈的荧光，还原态失去荧光。烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和和NADP+无荧光，而无荧光，而NADH和和NADPH有有460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。蓝色荧光。荧光法灵敏度高。4 4 同位素测定同位素测定法（法（isotope determinationisotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体或沉淀，就易于分离。物中有一种是气体或沉淀，就易于分离。5 5 电

9、化学电化学方法（方法（electrochemistryelectrochemistry） pH测定：对于某些酶促反应过程中会产生测定：对于某些酶促反应过程中会产生H或减少或减少H的反应来说，用的反应来说，用1/1000 pH单位精度的单位精度的pH计测定反应液的计测定反应液的pH变化，或为保持变化，或为保持pH不变而加不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物电位测定：在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的

10、电位差来测定电位变电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化。化。 电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流电流测定：以恒定电压的两个铂电极测电流变化。变化。6 6 化学分析化学分析法（法（chemical analysischemical analysis） 酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如用化学方法分析底物或产物的量。如ACC合成酶合成酶的产物的产物ACC的测定：加的测定：加HgCl2终止反应，加终止反应，加NaOCl-NaOH混合液使混合液使ACC转化成乙烯，再用气转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。相色谱测乙烯。

11、1-氨基环丙烷氨基环丙烷-1-羧酸羧酸（ACC）13.2、酶最适反应条件的测定 最适反应温度温度稳定性最适反应pHpH稳定性一、温度对酶促反应的一、温度对酶促反应的影响影响温度温度- -酶反应速率曲酶反应速率曲线与最适温度线与最适温度（optimum temperature）Fig. The effect of temperature on enzyme activity.102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)二、二、pHpH对酶促反应的对酶促反应的影响影响pH-酶反应速率曲线与最适pH（optimum

12、 pH）Fig. The effect of pH on enzyme activity.Tab. Optimum pH of some enzymes胃蛋白酶胃蛋白酶过氧化氢酶过氧化氢酶胰蛋白酶胰蛋白酶延胡索酸酶延胡索酸酶核酶核酶精氨酸酶精氨酸酶2345678910020406080100pHRelative Activity (%)13.3、酶动力学参数的测定1米氏方程SKSVvmmax Km为米氏常数为米氏常数（一）酶促反应（一）酶促反应u酶促反应式酶促反应式u米氏方程：米氏方程：K4（二（二）米氏常数）米氏常数Km1 1K Km m的含义的含义: : 当当K Km m=S=S时，时，V

13、=V= V Vmaxmax/2/2，K Km m值等于反应速率达到最值等于反应速率达到最大反应速率大反应速率V Vmaxmax一半一半时的底物浓度。时的底物浓度。2 2KmKm的意义的意义 KmKm是酶的一个是酶的一个特征性特征性常数常数反映反映酶对底物亲和力酶对底物亲和力的大小的大小 鉴别鉴别酶的种类酶的种类 判断判断可逆反应的速率可逆反应的速率 （三）（三）Vmaxu定义：定义：VmaxVmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。正比。 u应用：计算酶的转换数（

14、应用：计算酶的转换数（TN，催化常数，催化常数Kcat）单位）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。计算公式为：计算公式为： EVTNmax ( (单位是单位是s s-1-1) ) 计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致一致酶反应速度与酶反应速度与SS的关系的关系1. S Km时时： =VmaxS/ Km 一级反应一级反应2.若若SKm 时时： =Vmax 零级反应零级反应3.若若S = Km 时时： =1/2Vmax Km值的求法： 根据米氏方程双倒数作图法(Lineweaver-Burk

15、)maxmaxmV1S1VKv1 -4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v-1/Km1/Vmax斜率斜率=Km/VmaxFig.The Lineweaver -Burk double-reciprocal plot13.4、酶促反应的影响因素激活剂抑制剂1.激活剂 激活剂（activator）无机离子无机离子中等大小的有机分子中等大小的有机分子蛋白质蛋白质金属离子金属离子: :无机阴离子无机阴离子: :氢离子氢离子K+、Na+、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+ 等。等。Cl-等。等。某些还原剂某些还原剂：GSH、Cys、Vc金属螯合剂：金属螯

16、合剂：EDTA提高酶活性。提高酶活性。2抑制剂对酶促反应速度的影响 抑制作用 inhibition 抑制剂 inhibitor 抑制作用：酶分子中的必需基团的化学性质受到某种化抑制作用：酶分子中的必需基团的化学性质受到某种化学物质的影响而改变，导致酶活性降低，甚至丧失，但学物质的影响而改变，导致酶活性降低，甚至丧失，但并未引起酶蛋白的变性作用。并未引起酶蛋白的变性作用。(1)不可逆抑制作用（irreversible inhibition) 抑制剂以共价键和酶分子上必需基团结合（牢固结合），使酶活性降低或丧失，这种抑制剂不能用透析、超滤等物理方法解除抑制作用。不可逆抑制不可逆抑制专一性的不可逆抑

17、制专一性的不可逆抑制 非专一性的不可逆抑制非专一性的不可逆抑制 (2)可逆抑制(Reversible Inhibition) 通常以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去，使酶恢复活性。类型：竞争性抑制竞争性抑制（competitive inhibition）非竞争抑制非竞争抑制（ noncompetitive inhibition）反竞争抑制反竞争抑制（ uncompetitive inhibition） 1) 竞争性抑制ki2ki1VmaxvS（不变）（不变）KmKm (变大变大)With competitive inhibito

18、rNo inhibitor 竞争性抑制曲线竞争性抑制曲线VmaxKm v1=) I ki (1+Vmax1S11/S I 1/v I ki -Km ( 1+)-1-1/KmNo inhibitorWith competitive inhibitorFig. Lineweaver-Burk plot of competitive inhibitio13.2)非竞争性抑制Fig. Noncompetitive inhibitionSvVmax Vmax（变小）（变小）Km (不变不变)No inhibitorWith noncompetitive inhibitorFig. Noncompetit

19、ive inhibitio13.No inhibitorWith noncompetitive inhibitor I 1/S1/ v-1 / KmVmax1 I Ki (1+)S1VmaxKm v1=) I ki (1+Vmax1) I ki (1+3)反竞争性抑制1/v1/S-1/Km(1+I/ki)I正常正常表. 三种抑制作用总结类型类型 米氏方程米氏方程 Vmax Km无抑制剂无抑制剂 v = VmaxS/(Km + S) Vmax Km竞争性抑制竞争性抑制 v= VmaxSKi/(Km Ki + Km I + KiS ) 不变不变 增加增加非竞争性抑制非竞争性抑制 v = VmaxS

20、Ki/(Km + S)( Ki + I) 减小减小 不变不变反竞争性抑制反竞争性抑制 v = VmaxSKi/(Km Ki + S Ki + SI) 减小减小 减小减小13.5、实例菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的酶学性质研究最适温度温度稳定性最适pHpH稳定性酶动力学参数测定金属离子对酶活性的影响有机溶剂对酶活性的影响 酶活测定：取缓冲液 2.4mL 于试管中，加入 0.5mL0.01mol/L PNPP，45水浴 10min，加入 0.1mL 酶液，1min 后加入 1mL 1mol/L NaOH 终止 反应。对照组先加入 1mL 1mol/L NaOH，再加入 0.1mL 酶液。最后用分光光度计测

21、定 405nm 处的吸光度。 一个酶活力单位定义：在此反应条件下，每毫升溶液每分钟催化底物水解，产生 1mol 产物所需的酶量。1、最适反应温度 在 pH 9.0 条件下，分别测定 ALP 在 25、30、35、40、45、50、55、60和 65反应体系中的酶活力。以反应温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。 2、温度稳定性研究 将纯酶液与适量 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液（pH 9.0，含 0.1 mol/LNaCl）混合，分别在 25、35、45、55放置 4h，每小时测定一次酶活力。以静置时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。3、最适反应 pH

22、 在最适反应温度条件下，分别测定 ALP 在 pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 和 11.0 反应体系中的酶活力。其中，pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的缓冲液为 0.05mol/LTris-HCl 缓冲液；pH 9.5、10.0、10.5 的缓冲液为 0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；pH 11.0 的缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。以反应pH 为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。4、pH 稳定性研究 将纯酶液与适量 pH 值分别为 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 和11.0 的缓冲液混合，4冰箱内放置 4h 后，在最适反应温度和最适反应 pH 条件下，测定剩余酶活力。其中，pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的缓冲液 .05mol/LTris-HCl缓冲液；pH 9.5、10.0、10.5 的缓冲液为 0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；pH11.0 的缓冲液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。以反应时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。5、酶的动力学参数测定 在最适温度和最适 pH 条件下，测定不同底物浓度