蛋白质分离纯化

1、u 蛋白质由蛋白质由氨基酸氨基酸组成组成, ,且保留着游离的末端且保留着游离的末端 - -氨基氨基和和 - -羧基羧基以及侧链上的各种功能团。因此有些理化性质与以及侧链上的各种功能团。因此有些理化性质与氨基酸相同。氨基酸相同。u 蛋白质也是一类蛋白质也是一类两性电解质两性电解质, ,能和酸或碱发生作用。能和酸或碱发生作用。 可解离基团主要来自侧链上的功能团。可解离基团主要来自侧链上的功能团。u 如果是缀合蛋白质如果是缀合蛋白质, ,则还有辅基成分所包含的可解离则还有辅基成分所包含的可解离基团基团。在某在某pHpH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白

2、质的净电荷为零时的白质的净电荷为零时的pHpH称称等电点（等电点（pI）。）。没有其他盐类干扰时没有其他盐类干扰时, , 蛋白质质子供体基团解离出来蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pHpH称为称为等等离子点。离子点。u 蛋白质等电点：蛋白质等电点：u 蛋白质等离子点：蛋白质等离子点：u蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带由带芳香环的氨基酸决定芳香环的氨基酸决定的。其在的。其在280nm280nm处对紫外吸收能力处对紫外吸收能力的强弱顺序为：的强弱顺序为：色（色（ Trp

3、 ） 酪（酪（ Tyr ） 苯丙（苯丙（ Phe ）u 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体是一种稳定的亲水胶体（具有水化层和双电子层）（具有水化层和双电子层）。u 蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及效应以及不能通过半透膜。不能通过半透膜。u 半透膜：半透膜：多是由用赛咯吩多是由用赛咯吩（cellophane）制造，赛咯吩膜是制造，赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。

4、蛋白质在溶液中的蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生如果条件发生改变改变, ,破坏了蛋白质的稳定性破坏了蛋白质的稳定性, ,蛋白质就会从溶液中沉淀出来蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, ,那么那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。 u沉淀蛋白质的方法有以下几种沉淀蛋白质的方法有以下几种: :中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸

5、类沉淀法、加热变性沉淀法碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法. .u盐析：盐析：向蛋白质溶液中加入向蛋白质溶液中加入大量的中性盐大量的中性盐( (如：硫酸铵如：硫酸铵, ,硫酸硫酸钠或氯化钠等钠或氯化钠等),),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。层而聚集沉淀。1.1.中性盐沉淀法（盐析法）中性盐沉淀法（盐析法）u注意：注意：盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后, ,蛋白质又可溶解。蛋白质又可溶解。 2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法u 向蛋白质溶液中加入一定量的向蛋白质溶液中加入一定量的极性

6、有机溶剂极性有机溶剂( (如甲醇如甲醇, ,乙醇或丙酮等乙醇或丙酮等) ) 引起蛋白质引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常脱去水化层以及降低介电常数数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法u当溶液当溶液pH大于等电点大于等电点（pI）时时, ,蛋白质颗粒带负电荷，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子这样它就容易与重金属离子( (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等) )结结合成不溶性盐而沉淀。合成不溶性盐而沉淀。u应用应用 ：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆误服重金属盐

7、的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救等蛋白质进行解救, ,然后再服用催吐剂排出体外。然后再服用催吐剂排出体外。4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法u生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：如：鞣酸（单宁酸如：鞣酸（单宁酸, ,tannic acid) ) 钨酸钨酸( (tungstic acid，H2WO4) )、苦味酸、苦味酸(picric acid) )即即2,4,6- -三硝基酚三硝基酚, , 碘化钾等。碘化钾等。u某些酸类某些酸类:三氯醋酸三氯醋酸, , 磺基水杨酸磺基水杨酸（sulfosalicylic acid）

8、和硝酸等和硝酸等. . 当当 pH pI，蛋白质带正电荷与蛋白质带正电荷与生物碱试剂生物碱试剂某些酸根负离子某些酸根负离子 不溶性沉淀不溶性沉淀反应5.5.加热变性沉淀法加热变性沉淀法u几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。u当蛋白质处于等电点时当蛋白质处于等电点时, ,加热凝固最完全和最迅速。加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固的原因：加热变性引起蛋白质凝固的原因：可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电

9、点也破坏了带电状态。坏了带电状态。 蛋白质蛋白质沉淀的应用（制作豆腐）沉淀的应用（制作豆腐）制作方法：制作方法： 将大豆或豆饼加水浸泡后磨浆，过滤，将大豆或豆饼加水浸泡后磨浆，过滤，加水煮沸，加水煮沸，再再加加蛋白沉淀剂蛋白沉淀剂( (盐卤或石膏盐卤或石膏) )使蛋白质凝固沉淀，然后加压使蛋白质凝固沉淀，然后加压去水而成。去水而成。 u蛋白质变性的定义：蛋白质变性的定义： 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过

10、程称为蛋白质变性。改变，这一过程称为蛋白质变性。u蛋白质的复性：蛋白质的复性：蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。到天然构象的现象成为蛋白质的复性。u蛋白质变性后的特性：蛋白质变性后的特性： 生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变u茚三酮反应茚三酮反应（ninhydrin reaction)： 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可以与茚三酮发生反应呈现蛋白质经水解后产生的氨基酸也可以与茚三酮发生反应呈现蓝色蓝色。u双缩脲反应双缩脲反应

11、(biuret reaction)： 蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现现紫色或者粉红色紫色或者粉红色，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可以用来，此反应称为双缩脲反应。双缩脲反应可以用来检测蛋白质的水解程度。检测蛋白质的水解程度。反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色紫色或或粉粉红色红色二个以上肽键二个以上肽键 酚试剂反应酚试剂反应碱性碱性CuSO4及及磷钨酸磷钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基

12、自由氨基及羧基u 蛋白质在组织和细胞中一般都是以蛋白质在组织和细胞中一般都是以复杂的混合物复杂的混合物形式形式存在，每种类型的细胞都会含上千种不同的蛋白质。存在，每种类型的细胞都会含上千种不同的蛋白质。为什么要分离纯化蛋白质？为什么要分离纯化蛋白质？1.1.研究蛋白质的分子结构、组成和某些物化性质。研究蛋白质的分子结构、组成和某些物化性质。2.2.研究活性蛋白质的生物学功能，要求样品保持它的天然构象，研究活性蛋白质的生物学功能，要求样品保持它的天然构象，要尽量避免因变性而丢失活性。要尽量避免因变性而丢失活性。3.3.在制药工业中，需要把某种具有特殊功能的蛋白质纯化到规定在制药工业中，需要把某种

13、具有特殊功能的蛋白质纯化到规定的要求，特别注意把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。的要求，特别注意把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。u 到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法把到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中纯化出来。任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中纯化出来。u 但对任何一种蛋白质都可能但对任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离纯化选择一套适当的分离纯化程序程序以获得高纯度的制品。以获得高纯度的制品。1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 2.2.蛋白质粗提液的粗分级分离蛋白质粗提液的粗分级分离3.3.浓缩蛋白质的细分级分离浓缩蛋

14、白质的细分级分离4. 4. 蛋白质的结晶蛋白质的结晶(1) (1) 去除杂质：去除杂质： a.a.动物材料动物材料：先剔除结缔组织和脂肪组织。：先剔除结缔组织和脂肪组织。 b.b.种子材料种子材料：先去壳去种皮以免受单宁等物质污染。：先去壳去种皮以免受单宁等物质污染。 c.c.油料种子油料种子：先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。：先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 (2) (2) 细胞破碎：细胞破碎：选择适当的方法选择适当的方法, ,将组织和细胞破碎。将组织和细胞破碎。 a.a.动物材料：动物材料：电动捣碎机、匀浆机或用超声波处理。电动捣碎机、匀浆机

15、或用超声波处理。 b.b.植物材料植物材料：与石英砂或玻璃粉研磨、用纤维素酶处理。与石英砂或玻璃粉研磨、用纤维素酶处理。 c.c.细菌：细菌：与砂研磨与砂研磨, ,高压挤出或溶菌酶处理等。高压挤出或溶菌酶处理等。(1) (1) 去除杂质。去除杂质。(2) (2) 细胞破碎。细胞破碎。(3)(3)溶提：溶提：选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。 a.a.如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分, , 可利用可利用差差速离心速离心分离。分离。 b.b.如果所要纯化蛋白质与细胞膜或膜质细胞器结合如果所要纯化蛋白质与细胞膜

16、或膜质细胞器结合, ,则用超则用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。生物组织的破碎生物组织的破碎 溶解溶解 离心离心 蛋白的粗提取液蛋白的粗提取液1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 2.2.蛋白质粗提液的粗分级分离蛋白质粗提液的粗分级分离大量粗提液大量粗提液超过滤、凝胶过滤超过滤、凝胶过滤冷冻真空干燥或其他方法冷冻真空干燥或其他方法(PEG)(PEG) 浓缩蛋白质浓缩蛋白质少量蛋白质少量蛋白质粗提液粗提液盐析盐析等电点沉淀等电点沉淀有机溶剂分级有机溶剂分级稀释法稀释法浓缩蛋白质浓缩蛋白质3.3.浓缩蛋白质的细分级分离浓缩蛋白质

17、的细分级分离u主要方法：主要方法：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等。u辅助方法：辅助方法：电泳法电泳法（包括区带电泳（包括区带电泳, ,等电聚焦等）等电聚焦等）得到蛋白的精制品得到蛋白的精制品4. 4. 蛋白质的结晶蛋白质的结晶 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的质一定是均一的, ,但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。形成结晶。重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。

18、蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志, ,也是断定制品处于天然也是断定制品处于天然状态的有力指标。状态的有力指标。只有获得蛋白质晶体才能对它进行只有获得蛋白质晶体才能对它进行X X射线结构分析。射线结构分析。1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 2.2.蛋白质粗提液的粗分级分离蛋白质粗提液的粗分级分离3.3.浓缩蛋白质的细分级分离浓缩蛋白质的细分级分离4. 4. 蛋白质的结晶蛋白质的结晶u主要是根据蛋白质主要是根据蛋白质在在溶液中的性质不同溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。对蛋白质进行分离。分子大小分子大小溶解度溶解度电荷电荷吸附性质吸附性质对配体分子的生物

19、学亲和力对配体分子的生物学亲和力u主要方法：主要方法：1 1：透析透析（dialysis）和超过滤和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法凝胶过滤法1 1：透析和超过滤：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）u 将将浓缩液浓缩液装在一个用装在一个用半透膜半透膜的透析袋的透析袋内，两端都密封好，然内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有缓冲后将透析袋悬浮在一个装有缓冲液的容器内进行透析。液的容器内进行透析。u由于透析袋内溶液浓度高而由于透析袋内溶液浓度高而袋外浓度低，因此，透析袋内外袋

20、外浓度低，因此，透析袋内外将进行物质交换，将进行物质交换，袋内溶质向袋袋内溶质向袋外渗透，趋向浓度平衡外渗透，趋向浓度平衡。透析流程透析流程透析装置透析装置u 蛋白质等大分子不能透过半蛋白质等大分子不能透过半透膜，透膜，仍然留在袋内。仍然留在袋内。u 但蛋白质周围的小分子可以但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换。与缓冲液进行交换。u 通过多次更换透析液，就可通过多次更换透析液，就可除去小分子。除去小分子。透析流程透析流程超过滤装置超过滤装置u 使用使用压力或者离心力压力或者离心力使蛋白质溶液使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜（半透透过有一定截留分子量的超滤膜（半透膜），达到浓缩蛋白质

21、溶液的目的。膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。2：密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心u 蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小, ,而且也取决于它的而且也取决于它的密度密度。u 如果蛋白质颗粒在如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质具有密度梯度的介质（常用蔗糖梯度）（常用蔗糖梯度）中中离心时离心时, ,质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快, ,并且并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时, ,即停止即停止不前不前, ,最后各种蛋白质在离心管中被分

22、离成各自独立的最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带区带(zone)(zone)。装好具备密度装好具备密度梯度的介质溶液梯度的介质溶液密度梯度（区带）离心流程图密度梯度（区带）离心流程图离心离心收集分离后的各组分收集分离后的各组分加入：混和加入：混和蛋白质样品蛋白质样品离心装置离心装置3：凝胶过滤法凝胶过滤法u 凝胶过滤是按照凝胶过滤是按照蛋白质分子大小蛋白质分子大小进行分离的技术，又进行分离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。u 凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。的方法之一

23、。（1）凝胶过滤的介质）凝胶过滤的介质u 凝胶过滤所用的介质是装在凝胶柱里的凝胶过滤所用的介质是装在凝胶柱里的凝胶珠凝胶珠（或称凝胶颗粒、凝胶球）。（或称凝胶颗粒、凝胶球）。u其内部是其内部是多孔的网状结构多孔的网状结构，单个凝胶珠，单个凝胶珠本身象个本身象个“筛子筛子”。不同类型凝胶的筛孔的。不同类型凝胶的筛孔的大小不同大小不同 。凝胶柱凝胶柱 Sephadex 交联葡聚糖交联葡聚糖 Bio-gel P 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 Sepharose或或Bio-gel A 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（）凝胶介质颗粒的选择（）凝胶介质颗粒的选择u 凝胶的交联度或孔度凝胶的交联度或孔度（网孔大（网孔

24、大小）决定了凝胶的分级分离范围小）决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围进行凝胶合物的相对分子质量范围进行凝胶过滤。过滤。u凝胶过滤所用的凝胶孔径大小凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于的选择主要取决于要纯化的蛋白质要纯化的蛋白质分子量分子量。（）凝胶过滤的原理：（）凝胶过滤的原理：u 当含有大小不同的蛋白质样品加到凝当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就可以穿入珠子的内部。质就可以穿入珠子的内部。u 这样在洗脱时，小分子不但其运动这样在洗脱时，小分子不

25、但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻阻力也很大力也很大，所以，所以越小的蛋白质，把它们越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。u凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤分离蛋白质的流程凝胶过滤分离蛋白质的流程开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来洗脱收集洗脱收集上样上样样品上柱后，样品中的小样品上柱后，

26、样品中的小分子可以进入凝胶微孔，分子可以进入凝胶微孔，但是大分子不能进入。但是大分子不能进入。u这样大小不同的蛋白这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。质就被分离开来了。u 依次洗脱收集后，依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸通过紫外吸收法测定吸收峰。收峰。u主要方法：主要方法：1 1：透析透析（dialysis）和超过滤和超过滤（ultrafiltration）2：密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心3：凝胶过滤法凝胶过滤法u 主要方法：主要方法：1 1：等电点沉淀和等电点沉淀和PHPH值控制值控制2 2：蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析3 3：有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法4

27、4：改变温度改变温度1. .等电点沉淀和等电点沉淀和PH值控制值控制u 蛋白质是两性电解质，在不同的蛋白质是两性电解质，在不同的PH条件下，蛋白质分子的电荷条件下，蛋白质分子的电荷性质和数量会发生变化，性质和数量会发生变化，当当pH = pI，净电荷为零，相邻蛋白质分，净电荷为零，相邻蛋白质分子之间失去了静电斥力而趋向于聚集沉淀子之间失去了静电斥力而趋向于聚集沉淀。u即在不改变其它条件的情况下，即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白处于等电点时的蛋白质溶解度达到最低点。质溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的条件下蛋白质的溶解度迅速上升。溶解度迅速

28、上升。1. .等电点沉淀和等电点沉淀和PH值控制值控制u 由于由于不同的蛋白质等电点不同不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的，因此可以通过控制溶液的PHPH值值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。来沉淀混合物中的某种蛋白成分。u 通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。解于一定浓度的溶液中。2. .蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析u盐溶盐溶（salting-in） ：低浓度的中性盐可以增加：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶

29、现象。盐溶的形成原因：盐溶的形成原因：盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。的相互作用却加强，因而溶解度增高。u同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。u盐析盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很数值时（盐浓度高达一定数值时）

30、，蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。盐析的形成原因：盐析的形成原因：大量中性盐的加入使得水的活度降低，原来溶大量中性盐的加入使得水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，蛋白质表液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，蛋白质表面的疏水基团暴露并由于疏水作用而聚集沉淀。面的疏水基团暴露并由于疏水作用而聚集沉淀。u 盐析法是分离纯化蛋白质的过程中最常用的方法之一，盐析盐析法是分离纯化蛋白质的过程中最常用的方法之一，盐析出的蛋白质仍然保持蛋白的天然构象。出的蛋白质仍然保持蛋白的天

31、然构象。3. .有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法u 与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等） 能能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。的介电常数。4. .改变温度分离蛋白质改变温度分离蛋白质040oC之间之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外例外

32、：025oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。4050oC以上，以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。u一般蛋白质的分级分离操作一般都在一般蛋白质的分级分离操作一般都在04oC温度下进行。温度下进行。u 主要方法：主要方法：1 1：等电点沉淀和等电点沉淀和PHPH值控制值控制2 2：蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析3 3：有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法4 4：改变温度改变温度主要方法：主要方法：u 电泳电泳u 离子交换层析离子交换层析电泳概述电泳概述 电泳：电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态

33、的在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着其电性相反的电极移动，这种现象蛋白质分子，将向着其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳称为电泳(electrophoresis)。u电泳的方向与速度与下列因素有关：电泳的方向与速度与下列因素有关：电荷的正负性电荷的正负性电荷的多少电荷的多少颗粒的大小与形状。颗粒的大小与形状。电泳概述电泳概述u由于由于蛋白质蛋白质在指定的在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在不同，在电场中泳动速度不同电场中泳动速度不同。u因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离因此根据这一原理就可以从

34、蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。电泳分类电泳分类区带电泳：区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。移界电泳：移界电泳：是是Tiselius最早建立的电泳，它是在最早建立的电泳，它是在U U型管中进行的，型管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。等速电泳：等速电泳：需专用电泳仪

35、，当电泳达到平衡后，各区带随分成需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各区带随分成清晰的界面，并以等速移动。清晰的界面，并以等速移动。 等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成中自动形成pHpH梯度，使被分离物移动至各自等电点的梯度，使被分离物移动至各自等电点的pHpH处聚集处聚集成很窄的区带，且分辨率较高。从表面看与区带电泳相似，但成很窄的区带，且分辨率较高。从表面看与区带电泳相似，但原理不同。原理不同。按分离原理分类按分离原理分类按有无支持物分类按有无支持物分类：应用于蛋白质分离纯化中的电泳应用于蛋白质分离纯化中的电泳

36、u目前电泳的类型很多，但是它们都是在经典的自由电泳或称为目前电泳的类型很多，但是它们都是在经典的自由电泳或称为移动界面电泳移动界面电泳的基础上发展起来的的基础上发展起来的如图：如图：先在先在U U型管内使蛋白质溶液和型管内使蛋白质溶液和缓冲溶液之间形成清晰的界面，然后加缓冲溶液之间形成清晰的界面，然后加一外电场。由于界面处存在浓度梯度因一外电场。由于界面处存在浓度梯度因而产生折射率梯度，利用适当的光学系而产生折射率梯度，利用适当的光学系统（见沉降速度法）可以观察到界面的统（见沉降速度法）可以观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面移动。在电泳过程中，每个移动界面（峰）相当于某一特定的蛋白质

37、。（峰）相当于某一特定的蛋白质。区带电泳：区带电泳： 在支持物上电泳蛋白质混合物在支持物上电泳蛋白质混合物, ,将其分离成若干区带将其分离成若干区带根据支持根据支持物的不同物的不同滤纸电泳和薄膜电泳滤纸电泳和薄膜电泳粉末电泳：粉末电泳：支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉细丝电泳：细丝电泳：尼龙丝和其他人造丝电泳尼龙丝和其他人造丝电泳 微量电泳微量电泳凝胶电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶：适用于分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶：适用于分离蛋白质琼脂糖凝胶：适于分离核酸。琼脂糖凝胶：适于分离核酸。醋酸纤维薄膜电泳等醋酸纤维薄膜电泳等1.1.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(po

38、lyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳电泳u 它以它以聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶为支持物，一般为支持物，一般制成凝胶柱或制成凝胶柱或凝胶板凝胶板（不连续体系）。（不连续体系）。凝胶的浓度（孔径大小）、凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、缓冲液组分和离子强度、pHpH以及电场强度都是不同的以及电场强度都是不同的浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带（样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm0.1mm）分离成单区带分离成单区带聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： 聚丙烯酰胺化学性能稳定。聚丙烯酰胺化学性能稳定。 聚丙烯酰

39、胺在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，易观察，聚丙烯酰胺在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，易观察，可用检测仪直接测定。可用检测仪直接测定。 聚丙烯酰胺凝胶孔径可调，根据被分离物的分子量选择合适的聚丙烯酰胺凝胶孔径可调，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径大小。浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径大小。 分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，有更高的分辨率。和电荷效应为一体，有更高的分辨率。 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分应用广泛

40、，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)u SDS-PAGE: SDS-PAGE:是用是用SDSSDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸3 35 5分钟）。分钟）。u 通过加热和通过加热和SDSSDS可以使蛋白质变性：可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单多亚基

41、的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。亚基。二硫键被切断。u SDS SDS是带有负电荷的分子，是带有负电荷的分子，所有结合所有结合SDSSDS的蛋白质的形状近似于的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。u 电泳时电泳时SDS-SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。质分子量。 浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳

42、装置点样点样浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置电泳结果电泳结果每条带代表不同分子量的蛋白质或者肽段，这样蛋白质就分离开了每条带代表不同分子量的蛋白质或者肽段，这样蛋白质就分离开了2.2.毛细管电泳毛细管电泳 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。和毛细管电泳。 用途：用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNADNA片片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、段（例如合成的寡核苷酸）和核酸

43、以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量甚至金属离子。用样量5 530l 1mg/ml30l 1mg/ml溶液。溶液。3.3.等电聚焦电泳等电聚焦电泳u等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于也可用于蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定。u蛋白质混合物是在具有蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的其等电点的pHpH梯度处，并形成一个很窄的区带

44、。梯度处，并形成一个很窄的区带。u等电聚焦可以把人的血清分成等电聚焦可以把人的血清分成4040多个条带。此技术特别适用于多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的同功酶的鉴定。只要它们的pI有有0.02（甚至（甚至0.02）pH单位的差别单位的差别就能分开。就能分开。u 实际上是利用缓冲液在实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个方向制造一个pH梯度梯度。所。所用的缓冲液是低分子量的有用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。物称之两性电解质。等电聚焦电泳装置等电聚焦电泳装置u 当蛋白质样品在这样的

45、当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的都将迁移至与它的pI 相一相一致的致的pH处，处，具有不同具有不同pI的的各种蛋白质最后都迁移至凝各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的胶中相应的pH处，处，达到分达到分离的目的。离的目的。4.4.蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis）u 将将等电聚焦电泳等电聚焦电泳与与SDS-PAGESDS-PAGE结合起来的电泳技术。结合起来的电泳技术。电泳方向电泳方向电泳方向电泳方向等电聚焦电泳等电聚焦电泳SDS-PAGEu 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图

46、，双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映水平方向反映出蛋白在出蛋白在pIpI上的差异上的差异，而，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别垂直方向反映出它们在分子量上的差别。u 所以所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。电点相同而分子量不同的蛋白质分开。u是根据蛋白质的是根据蛋白质的等电点差异分离等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。蛋白质混合物的柱层析方法。特种多缓冲交换特种多缓冲交换剂剂PH降低降低混和蛋白质样品混和蛋白质样品特种多缓冲液特种多缓冲液特种多特种多缓冲液缓冲液收集

47、收集特种多特种多缓冲液缓冲液收集收集特种多特种多缓冲液缓冲液依次收集不同的蛋白组分依次收集不同的蛋白组分5.5.层析聚焦层析聚焦(P(P310310) )u 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质：支持介质： 对蛋白质交换容量大对蛋白质交换容量大阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂CM纤维素纤维素(弱酸型弱酸型)P-纤维素纤维素(中强酸型中强酸型)SE- 纤维素纤维素(强酸型强酸型)SP-Sephadex(强酸型强酸型)AM纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)PAB-纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)DEAE-纤维素纤维素(中

48、强碱型中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型中强碱型)TEAE-纤维素纤维素(强碱型强碱型)QAE-Sephadex(强碱型强碱型)6.6.离子交换层析离子交换层析(P310)以阳离子交换型树脂为例以阳离子交换型树脂为例u将带有耐酸性非常强的磺酸根将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-NaSO3-Na（以盐的形式出现）（以盐的形式出现）的的强阳离子交换树脂（强阳离子交换树脂（固定相固定相）填充到层析柱）填充到层析柱中。中。u将含有样品的将含有样品的流动相流动相加入层析柱中，加入层析柱中，样品中带有正电荷样品中带有正电荷的蛋白质的蛋白质X X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，通过静

49、电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果结果X X与与NaNa交换（阳离子交换），交换（阳离子交换），形成形成SO3-XSO3-X，蛋白质就结，蛋白质就结合到了层析柱上合到了层析柱上。u在样品与树脂充分交换后，可通过在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的度，或改变流动相的pHpH，或是同时采用这两种方法，或是同时采用这两种方法，就可以，就可以将结合于树脂上的蛋白质将结合于树脂上的蛋白质X X成分，按照它们与树脂结合的强成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地弱程度不同逐一地洗脱洗脱下来。下来。结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式：结合到

50、层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： 洗脱方式洗脱方式恒定浓度洗脱恒定浓度洗脱改变盐浓度或改变盐浓度或pH洗脱洗脱跳跃式分段洗脱跳跃式分段洗脱渐进式连续改变渐进式连续改变(梯度洗脱梯度洗脱)简单型混合器简单型混合器复合型混合器复合型混合器u 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。力和解吸性质不同而达到分离目的。u 典型的吸附剂：典型的吸附剂：硅胶硅胶, ,氧化铝和活性炭等氧化铝和活性炭等. . 主要用来分离非离子、水不溶性化合物主要用来分离非离子、水不溶性化合物(P312) 亲和层析亲和层析(affini

51、ty chromatography)：是利用蛋白质分子对是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力其配体分子特有的识别能力, , 即生物学亲和力，建立起来的一种有即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。效的纯化方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。物中分离出来，纯度相当高。(P313)u把某一待纯化把某一待纯化蛋白质的特异配体蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价通过适当的化学反应共价地地连接到连接到像琼脂糖凝胶这一类的像琼脂糖凝胶这一类的载体表面载体表面。u向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化

52、的向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的蛋白质蛋白质由于与载体上的配体结合而被吸附由于与载体上的配体结合而被吸附，而其它蛋白质和杂质成分，而其它蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。通过平衡液的洗涤可以被除去。u被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液（高浓度洗脱液）洗脱洗脱液）洗脱( (亲合洗脱亲合洗脱) )并进行收集。并进行收集。样品样品层析柱层析柱凝胶上的配体凝胶上的配体样品中待分离的的蛋白成分样品中待分离的的蛋白成分u 蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的样品

53、成分被平衡液洗脱下来。样品成分被平衡液洗脱下来。样品样品凝胶上的配体凝胶上的配体样品中能与配体特异结合的蛋白成分样品中能与配体特异结合的蛋白成分高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物分子大小：分子大小：溶解度：溶解度：电荷：电荷：吸附性质：吸附性质：对配体分子对配体分子的亲和力：的亲和力：透析和超过滤透析和超过滤、密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法密度梯度（区带）离心、凝胶过滤法等电点和等电点和PHPH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析亲

54、和层析亲和层析u 用化学分析方法测定出蛋白质中某一用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素微量元素的含量的含量, ,可以计算出可以计算出蛋白质的最低相对分子质量蛋白质的最低相对分子质量。u如如Fe，并假设每个蛋白质分子中只有，并假设每个蛋白质分子中只有1个个Fe原子，则原子，则由此可算出蛋白质的由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。最低相对分子质量。例如例如: :某种蛋白含铁量为某种蛋白含铁量为0.335%, 0.335%, 其最低相对分子质量其最低相对分子质量( (假设此假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白) )可按下式计算出可按下式计算出: : 若此蛋白含若此蛋

55、白含4 4个铁原子（如血红蛋白）个铁原子（如血红蛋白） ，则：，则：Mr = 16 700486 600最低相对分子质量最低相对分子质量Mr铁的原子质量铁的原子质量铁的百分含量铁的百分含量=55.80.335 100 =100 = 16 700即某蛋白的真实即某蛋白的真实 Mr = 16 700n （n n为含有的铁原子的数目）为含有的铁原子的数目）渗透现象：渗透现象：溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向的净移动现象。单方向的净移动现象。半透膜半透膜溶剂溶剂蛋白质溶液蛋白质溶液渗透压渗透压h小分子可以通过，但蛋白小分子可以通过，但蛋

56、白质等大分子不能通过。质等大分子不能通过。Mr = RTlim ( /c)c 0R: 气体常数；气体常数； T：绝对温度；绝对温度； ：渗透压；：渗透压； c: 溶质的浓度。溶质的浓度。 注意事项：注意事项：尽量采用尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透做为半透膜内外的溶剂，以避免膜内外的溶剂，以避免PHPH值对渗透压的影响。值对渗透压的影响。 渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：优点：优点：装置简单，准确度相对高。装置简单，准确度相对高。缺点：缺点：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果溶液含多不能区别所测蛋白

57、质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。u 扩散（平移扩散）：扩散（平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。u 扩散系数扩散系数D D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。面积所扩散的溶质量。u 扩散系数扩散系数D D的特点：的特点：(2)(2)扩散系数一般不单独用来决定扩散系数一般不单独用来决定M Mr r , ,但如后面所说的与沉降系但如后面所说的与沉降系数结

58、合起来数结合起来, ,可以给出蛋白质的精确相对分子质量。可以给出蛋白质的精确相对分子质量。(1)(1)随随 M Mr r的增加而降低的增加而降低, ,但扩散系数对但扩散系数对M Mr r 的变化并不敏感。的变化并不敏感。 需转速为需转速为60,00080,000rpm的超速离心机的超速离心机 测测Mr常用两种方法常用两种方法：沉降速度法沉降速度法沉降平衡法沉降平衡法u沉降：沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质

59、的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。的速度与蛋白质的分子大小、形状、密度以及溶液的性质有关。u 沉降系数沉降系数( (s):):单位离心场的沉降速度。单位离心场的沉降速度。液面液面界面界面溶剂溶剂坪区坪区池底池底 界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。如如人血红蛋白沉降系数人血红蛋白沉降系数s=4.46Ss=4.46S

60、，即，即4.464.4610101313秒。秒。 为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的成标准条件下的s s值。沉降系数的标准条件定为值。沉降系数的标准条件定为2020 C,C,溶剂为水溶剂为水。校校正后的沉降系数用正后的沉降系数用s s2020，w w表示。表示。 大部分生物大分子的大部分生物大分子的沉降系数介于沉降系数介于1 11010-13-13到到2002001010- -1313秒的范围秒的范围。因此：把。因此：把1010-13-13秒作为一个单位秒作为一个单位，称为斯维得，称为斯维得贝格单位或称贝格