浅谈转基因技术在农作物抗虫研究上的应用

1、·生物技术在农业上的应用论文·题目：浅谈转基因技术在农作物抗虫研究上的应用论文提纲一、国内外的研究进展 1.1国外的研究情况 1.2我国的研究现状2、 转基因技术在农作物抗虫研究上的应用 2.1.苏云金杆菌毒蛋白基因 2.1.1概述 2.1.2机理及应用 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述 2.2.2机理及应用 2.3蛋白酶抑制剂基因 2.3.1概述机理及应用三、结论与展望 3.1结论 3.2展望浅谈转基因技术在农作物抗虫研究上的应用【摘要】随着转基因植物商品化进程的不断加深，转基因植物的发展前景也越来越来起人们的关注，本文笔者于植物抗虫基因工程在国内外的进展情况的基础上

2、，就转基因技术在农作物抗虫研究上的应用进行探讨研究。【关键词】转基因技术 抗虫机理 基因虫害严重影响农业生产，影响作物的产量和品质，制约农业经济的稳定发展。长期以来人们普遍采用化学杀虫剂来控制害虫，但随着时间的推移尤其是化学农药的大量、不合理的使用，带来了如农药残留、害虫产生抗药性、杀灭天敌等自然生态平衡被破坏、环境污染的严重问题。利用植物抗虫基冈工程培育的抗虫作物，可以避免害虫危害，还具有成本低、保护全、特异性强等优点，从而倍受关注，成为当前农业生物工程研究的一个热点。植物抗虫基因工程是植物基因工程中最为重要的研究内容之一。自从l987年比利时植物遗传所的Vaeck等AYI首先报道了外源抗虫

3、基阁转入炯草，随后Barton等和美国孟山都公司的Fishhoff等人也都报道了他们获得抗虫转基因烟草和番茄植株的研究，由此开创了植物抗虫育种的新领域。目前已有多种植物抗虫基因在烟草、水稻、玉米、棉花、马铃薯等多种作物上获得了转基因抗虫植株，有的已申请到田间释放和商品化生产。本文笔者于植物抗虫基因工程在国内外的进展情况的基础上，就转基因技术在农作物抗虫研究上的应用进行探讨研究。一、国内外的研究进展 1.1国外的研究情况 1987年比利时科学家首次成功地将Bt毒蛋白基因导人烟草以来，转基因抗虫植物的研究日新月异、硕果累累。迄今为止，得到的抗虫转基因植物种类已达25种以上，有的已进入商品化生产1。

4、根据它们的来源，已克隆得到的抗虫基因可分为三类：第一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，主要是苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因；第二类是从植物组织中分离出的抗虫基因，主要为蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因(Lec)等，应用最广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)；第三类是从动物体内分离的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等2。 1.2我国的研究现状 在报道了首例有关转Bt基因烟草和番茄的研究后，Bt基因被相继转入到棉花、水稻、玉米、苹果和核桃等作物中，目前已经有6O多种Bt基因被报道。美国用农杆菌介导法将Bt基因导入壳籽棉，育成世界上首例抗虫棉，棉铃虫为害率下降5O。

5、1996年美国Bt基因抗虫棉种植面积72万hm，约占总植棉面积143。我国是继美国后育成抗虫转基因棉的第二个国家，育成中国第一代单价抗虫棉的抗虫性在9O 以上，减少用药6O 8O，增产3O4O 4。1992年底中国农科院生物技术研究中心的郭三堆等5 人在国内首先人工合成了Bt基因之后，又对豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因进行了修饰，构建了同时带有这两种基因的双价杀虫基因高效植物表达载体，再通过花粉管通道转化技术导入我国不同棉花生产区的主栽品种，已获得了数十个双价转基因抗虫棉株系。双价抗虫转基因棉花研制成功并大面积进入田间试验，目前在国外尚未见报道，标志着我国在抗虫棉的研究方面已达到了国际先进

6、水平。 二、转基因技术在农作物抗虫研究上的应用 2.1.苏云金杆菌毒蛋白基因 2.1.1概述 苏云金芽孢杆菌(研)晶体蛋白基因，克隆于苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)是一种革兰氏阳性菌，分类上属原核生物，细菌纲，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植被、昆虫尸体中。Bt杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的。德国科学家Berliner最早从患病地中海螟中分离到了这种芽孢杆菌，并命名为“ Bacillus thuringiensis n.sp.。苏云金芽孢杆菌可产生对鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Col

7、eopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质(Kozicl M G etal，1993)。由于Bt杀虫蛋白对不同的昆虫具有很强的专一性和高度选择性，对植物、人畜无害。据统计已有60多种Bt基因被报道，根据它们的杀虫范围和基因序列的同源性可大致分为六大类，即Cryl、cry2、Cry3、Cry4、Cry5和Cyt，每一类又包含有不同的亚基，前五类称为晶体蛋白基因家族(Crystal Protein Coden Gene)，第六类称为细胞外溶解性晶体蛋白基因(Cytolytic ProteinCoden Gene)。 2.1.2机理及应用 从基因结构来说，由于

8、苏云金芽孢杆菌晶体蛋白来源于原核生物，在基因结构上同真核生物有着显著的区别，在转入植株后，在基因的表达上存在着不稳定的因素，表现为不表达或表达极弱等，故植株表现为抗性很弱或无抗性。研究发现在不改变表达蛋白结构的基础上，根据植物偏爱，适当的对编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因进行改造后，在植物的表达效率大大的改善。后来，研究者采用完全改变基因结构的方法(如，G+C的含量有原来的37提高到49 ；18个Polv(A)序列减少到1个；ATTTA序列由13个减为零等)使基因结构完全符合植物的基因结构，结果得到了表达量可观的转化植株6。有趣的是，新近克隆的Crv1 la5基因可不经改造而在植株中高效表达7，

9、这一发现引起了科研工作者的极大兴趣，具有特殊的意义。 2.2植物凝集素基因 2.2.1概述Lectin是一种含有非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的植物保守性(糖)蛋白，主要存在于很多植物的种子和营养组织中。自1988年Stillmark在蓖麻中发现一种蛋白酶细胞凝集因子以来，人们已经分离了几百种凝集素，并研究了其生化结构和功能，同时还克隆了许多凝集素基因。目前成功应用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有：雪花莲凝集素(GNA)基因，豌豆凝集素(PLec)基因，麦胚凝集素(WGA)基因，半夏凝集素(PTA)基因。有人研究发现稻胚凝集素可以与N一乙酰葡萄胺专化结合，具有同WGA相似的抗虫性。

10、我国王亦菲(2ooo)以普通水稻为模板，扩增出了凝集素基因。部分凝集素对哺乳动物也有显著毒害，如WGA、PTA，这样就使得这些凝集素不适于转基因。而GNA对哺乳动物毒害较小，因此大部分工作就集中在了GNA基因的转化研究上，迄今为止GNA基因已经转入到马铃薯、番茄、烟草、莴苣等9种作物。研究证明GNA对刺吸式口器的昆虫如蚜虫、褐飞虱等同翅目及线虫有特效，对咀嚼式口器也有中等毒杀作用82.2.2机理及应用 凝集素是植物界普遍存在的一类保守性很强的蛋白质，在植物体内有着特殊的生理功能。从现有的转基冈植物的抗虫性来看，禾本科中典型的植物凝集素麦胚凝集素(WGA)，对欧洲玉米螟有良好的抗性，并且KSPo

11、well等人将WGA以0.1(wv)饲喂稻褐飞虱(Nilapaveta lugens)超过24h，同对照相比蜜汁滴数显著降低了54，尽管平均喂WGA的昆虫分泌蜜汁体积小于对照，但差异并不 著(cp>O.05)；雪莲花凝集素(GNA)对蚜虫、叶蝉、稻褐飞虱等同翅目吸食陛害虫有极强的毒性，另外由于GNA具有高度特异结合甘露糖寡聚体,使其在分析，纯化糖蛋白方面成为有前途的工具，目前已成功应用于纯化鼠,清中免疫球蛋白一M的单克隆抗体；豌豆外源凝集素(peaLectin)能抑制豇豆象的生长，并且已分离应用到转基因烟草和马铃薯等作物中，抗虫效果比较明显。 当昆虫进食GNA后，GNA在昆虫的消化道中与

12、肠道膜上相应的糖蛋白专一性的结合，降低膜的透性，从而影响营养的吸收；GNA还能越过上皮的阻碍，进入昆虫循环系统，造成对整个昆虫的毒性；同时GNA还可以在昆虫消化道内诱发病灶，促进消化道细菌繁殖，达到抗虫的目的。GNA对幼虫的存活率、体重、拒食率、化蛹、羽化率及生殖都有很大的影响9 。 2.3蛋白酶抑制剂基因 2.3.1概述 蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitor，PI)是自然界最丰富的蛋白种类之一，存在于所有的生命体中，与前述苏云金杆菌相比，更具有抗虫谱广、对人畜无剐作用及昆虫不易产生耐受性等优点(Gatehouse，1988),对维持生物体的正常代谢和预防外来蛋白水解酶对机体

13、的破坏起着重要作用。其一般为60一l20个氨基酸组成的多肽，分子量约为825kD。20世纪70年代，人们在研究植物蛋白酶抑制剂时发现当马铃薯、两红柿等作物在受到昆虫噬食或机械损伤f1寸，局部蛋白酶抑制剂含量骤增，从而推测可能是植物抵抗害虫的一种天然防御系统。在植物界，现已发现了包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂等近l0个蛋白酶抑制剂家族。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂在植物抗虫基因工程中有更大的应用价值，因为多数昆虫所利用的蛋白消化酶正是丝氨酸类蛋白消化酶，尤其是类胰蛋白酶，而丝氨酸蛋白酶抑制剂又可分为BowmanBirk、Kunitz、PII和PIII家

14、族等不同的类型11410其中又以BowmanBirk家族的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpT I)研究得较为深人且应用广泛。 2.3.2机理及应用 1987年英国的Hilder等把编码CpT I的eDNA导人烟草获得转CpT I基冈的抗虫植株。研究表明，该转基因烟草能抗烟草夜蛾、玉米穗蛾、棉铃虫和粘虫等，且发现其CpT I的表达量与抗虫性里正相关。此后，世界上的一些实验室和公司相继把cpT l基冈转入水稻、油菜、白薯、苹果和杨树等具有重要经济价值的植物中。墨西哥大学、美国的Mon santo公司也把该基因转入棉花用于防治棉铃虫、棉象鼻虫和螟蛉虫。中国农科院生物技术中心也正在将人工合成的毒素基因与改造的

15、CpT I基因经重组构成双价抗虫基因导人棉花等作物。此外，将马铃薯蛋白酶抑制剂基因导人烟草和水稻，还获得了表达水稻巯基蛋白酶抑制剂基因的转基因烟草工程植株。植物生长发育过程中PI的合成具有阶段特异性(stage-specific)，即P1只在某一阶段合成，随后将被降解10 。其机理尚待进一步研究。植物对PI具有损伤诱导表达机制11 ，许多植物受到昆虫侵害后局部组织或整个植株的PI含量会急剧增加，从而抑制昆虫的摄食。PI的诱导合成是植物对外界损伤的种反应12 ，诱导的PI可以更有效抑制昆虫肠道中蛋白酶的活性13 。马铃薯蛋白酶抑制剂一II(Dotato inhibitor II，PTII)基因具

16、有损伤诱导型启动子14，如果使用这类启动子调控其它外源抗虫基因在植物中的表达，将具有特殊的意义。三、结论与展望 3.1结论 目前，虽然有各种各样的抗虫基因和基因表达载体相继问世，但是由于基因转移方法上的原因，有些抗虫基因无法转移给植物或者转化频率很低。要从事抗虫基因的转移，一方面要了解抗虫基因的来源、作用，另一方面要掌握遗传转化的理论、方法。其中如何提高转化过程中植株再生频率也是问题的关键之一。由于在室内和田问都已发现昆虫对Bt。产生了抗药性，因此如何防止抗性扩散是转抗虫基因遗传工程所面临的一大问题人们已采取了一些降低选择压力的方法来克服这个问题，如将转基因植株与非转基因植株混种、使Bt基因的

17、表达局限在特定器官、开辟隔离带、使用化学调节性启动子等。 已有报道，将不同的抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因同时转入烟草，具有加性抗虫作用。由于植物的害虫是多种多样的，如何提高转基因植物的抗虫广谱性，也是需要进一步研究的课题。除了使植物获取得抗虫性外，也可以对昆虫进行改造可将显性的雌性不育基因转入昆虫胚胎的基因组中，以育成不育昆虫。总之，基因工程并非解决一切问题的万全之策，只有将传统的抗虫育种、遗传工程及田间综合防治相互结合起来，才能更好地控制害虫发生，更好地改良植物。 3.2展望植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了丰硕成果，抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯的商业化推广证明了这项技术的

18、实用性。在转基因植物体内，抗虫基因在植物整个生活周期中都存在并行使其抗虫功能，克服了使用农药控制虫害的时效性和易被冲刷、流失、分解等缺点，又防止了化学农药在食物中的残留危害人体健康和对环境造成的污染等问题。多种抗虫基因的同时开发及其互补和协同作用。对于控制昆虫产生抗性，提高抗虫植物的抗虫能力及抗虫范围前景是乐观的。另外，我们必须认识到。基因工程并非是解决一切问题的万全之策。通过植物基因工程得到的只是一种人工种质新材料。而不是生产上可以立即应用的新品种，它必须经过常规育种考验。只有将传统的抗虫育种、遗传工程及田间综合防治相互结合起来，才能更好地控制害虫发生，更好地改良植物。因此，植物基因工程技术

19、必须与常规育种相结合，并经大田试验将转基因植物的外源目的基固持续遗传给后代或通过有性繁殖转移到其他品种上去。可以相信，随着研究的不断深入，目前抗虫转基因工程中存在的各种问题必将得到解决，在不久的将来会有更多的抗虫作物新品种从实验室走向大田。【参考文献】1 Gathehouse AMR，Hilder VA，BoulterDPlant Genetic M anipulation for Crop ProtectionDBCAB internitonal，1992，1551812 谢先芝抗虫转基因植物的研究进展及前景J生物工程进展1999，19(6)：47513 崔洪志，郭三堆Bt毒蛋白抗虫植物基因

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