动物性食品中禽流感病毒检验

1、动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验 知识目标：知识目标： 了解禽流感病毒的生物学特性了解禽流感病毒的生物学特性 掌握禽流感病毒检验方法掌握禽流感病毒检验方法 掌握禽流感病毒的卫生评价与处理掌握禽流感病毒的卫生评价与处理 能力目标：能力目标： 能对可疑病料进行采集及处理能对可疑病料进行采集及处理 能对禽流感病毒教学分离与鉴定能对禽流感病毒教学分离与鉴定动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验禽流感病毒禽流感病毒n 禽流感（禽流感（AIAI）是由）是由A A型流感病毒引起的禽类的一种严重疾病。感染后型流感病毒

2、引起的禽类的一种严重疾病。感染后的家禽可表现亚临诊症状、轻度呼吸系统疾病、产蛋量降低或急性全的家禽可表现亚临诊症状、轻度呼吸系统疾病、产蛋量降低或急性全身致死性疾病。身致死性疾病。n 病毒广泛分布于各种家禽和野禽。从迁徙水禽，尤其鸭中分离的病毒病毒广泛分布于各种家禽和野禽。从迁徙水禽，尤其鸭中分离的病毒最多；流感在家禽中对火鸡和鸡的危害最严重。最多；流感在家禽中对火鸡和鸡的危害最严重。n 美国为扑灭美国为扑灭19831983年秋至年秋至19841984年暴发的禽流感（年暴发的禽流感（H H5 5N N2 2），花费高达），花费高达6 6千千万美元。香港地区为扑灭万美元。香港地区为扑灭19971

3、997年的禽流感（年的禽流感（H H5 5N N1 1）也付出了巨大代价）也付出了巨大代价，不仅使大批鸡死亡，而且造成，不仅使大批鸡死亡，而且造成1313人感染禽流感病毒并发病，其中人感染禽流感病毒并发病，其中4 4人死亡。我国人死亡。我国20052005年冬在很多地方也发生了禽流感疫情，严重影响了年冬在很多地方也发生了禽流感疫情，严重影响了禽肉产品的出口，给养殖业带来很大损失。禽肉产品的出口，给养殖业带来很大损失。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 禽流感（禽流感（AIAI）的潜伏期从几个小时到几天不等，其长短与病毒的致病）的潜伏期从几个小时

4、到几天不等，其长短与病毒的致病力高低，感染强度，传播途径和易感禽的种类有关。力高低，感染强度，传播途径和易感禽的种类有关。n 由由A A型禽流感病毒所引起的禽流感，因感染禽的种类、年龄、性别、并型禽流感病毒所引起的禽流感，因感染禽的种类、年龄、性别、并发感染情况及所感染毒株的毒力和其它环境因素等不同而表现出的症发感染情况及所感染毒株的毒力和其它环境因素等不同而表现出的症状很不一致，症状可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神经系统。通常状很不一致，症状可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神经系统。通常呈现体温升高，精神沉郁，饮食欲减少，消瘦，母鸡产蛋量下降。呼呈现体温升高，精神沉郁，饮食欲减少，消瘦，母鸡产

5、蛋量下降。呼吸道症状表现不一，如咳嗽、喷嚏、罗音、甚至呼吸困难。病鸡流泪吸道症状表现不一，如咳嗽、喷嚏、罗音、甚至呼吸困难。病鸡流泪，羽毛松乱，身体卷缩，头和颜面部水肿、皮肤发绀（冠和肉垂），羽毛松乱，身体卷缩，头和颜面部水肿、皮肤发绀（冠和肉垂），有神经症状及下痢。以上这些症状可能单独出现，或几种同时出现。有神经症状及下痢。以上这些症状可能单独出现，或几种同时出现。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 禽流感特征性病理变化为水肿、充血、出血。急性型典型禽流感特征性病理变化为水肿、充血、出血。急性型典型症状为心肌炎、心包炎，腺胃乳头水肿、出血，肌

6、胃角质症状为心肌炎、心包炎，腺胃乳头水肿、出血，肌胃角质层下出血，肌胃与腺胃交界处呈带状或环状出血，呼吸道层下出血，肌胃与腺胃交界处呈带状或环状出血，呼吸道有大量炎性分泌物或黄白色干酪样坏死，气管粘膜出血。有大量炎性分泌物或黄白色干酪样坏死，气管粘膜出血。 动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验 一、生物学特性一、生物学特性n 流感病毒为正粘病毒科流感病毒属的成流感病毒为正粘病毒科流感病毒属的成员，根据核蛋白（员，根据核蛋白（NPNP）和基质蛋白（）和基质蛋白（MPMP）的不同可分为）的不同可分为A A、B B、和、和C C三个血清型三个血清型。A

7、A 型流感病毒能感染多种动物，包括型流感病毒能感染多种动物，包括人、禽、猪、马、海豹等，人、禽、猪、马、海豹等，B B型和型和C C型则型则主要感染人。而且主要感染人。而且A A型流感病毒的表面型流感病毒的表面糖蛋白比糖蛋白比B B型和型和C C型的变异性高。型的变异性高。n A A型禽流感病毒的型禽流感病毒的HAHA已发现已发现1616种，种，NANA有有1010种，分别有种，分别有H1H11616，N1N11010命名。命名。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验将无菌有感染性鸡胚囊液将无菌有感染性鸡胚囊液1 1：1010稀释后，静脉接种稀释后，

8、静脉接种8 8只只4 48 8周龄易感鸡周龄易感鸡，每只，每只0.2mL0.2mL。接种后。接种后1010天内死亡率天内死亡率75%75%，为高致病性禽流感病毒。，为高致病性禽流感病毒。分离物符合上述标准后，其它鸡群可依据流行病学、临床症状及相同分离物符合上述标准后，其它鸡群可依据流行病学、临床症状及相同亚型血凝素抗体测定来确定是否为感染高致病性的禽流感病毒。亚型血凝素抗体测定来确定是否为感染高致病性的禽流感病毒。如果致病力试验中致死率不足如果致病力试验中致死率不足75%75%，或血凝素为，或血凝素为H5H5及及H7H7亚型的病毒，亚型的病毒，需要进一步的试验和验证。需要进一步的试验和验证。如

9、果分离的禽流感病毒只能致死如果分离的禽流感病毒只能致死8 8只中的只中的1 15 5只，但能在没有胰蛋酶只，但能在没有胰蛋酶存在的细胞培养物上生长并能产生细胞病变（存在的细胞培养物上生长并能产生细胞病变（CPECPE）或形成蚀斑，则）或形成蚀斑，则必须先测定其必须先测定其HAHA相关多肽的氨基酸序列后才能宣布该分离物是否为高相关多肽的氨基酸序列后才能宣布该分离物是否为高致病性毒株。致病性毒株。鉴定分离株是否为高致病性禽流感（鉴定分离株是否为高致病性禽流感（HPAIHPAI）及是否执行扑灭计划）及是否执行扑灭计划动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验

10、病毒形态病毒形态n 甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径8080120nm120nm，有囊膜。基，有囊膜。基因组为分节段因组为分节段 单股负链单股负链RNARNA。依据其外膜血凝素（。依据其外膜血凝素（H H）和神经氨）和神经氨酸酶（酸酶（N N）蛋白抗原性的不同，目前可分为）蛋白抗原性的不同，目前可分为1616个个H H亚型（亚型（H1H1H16H16）和）和9 9个个N N亚型（亚型（N1N1N9N9）。感染人的禽流感病毒亚型主要为）。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1H5N1、H9N2H9N2、H7N7H7N7，其中感染，其中感染H5N1H5N1的患者病

11、情重，病死率高。的患者病情重，病死率高。n 研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株（H5N2H5N2、H7N7H7N7、H9N2H9N2），可经），可经6 69 9个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（个月禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株（H5N1H5N1）。）。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验流感病毒流感病毒HA 血凝素纤突血凝素纤突NA 神经氨酸酶神经氨酸酶动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 禽流感病毒对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。常用消毒剂

12、容易禽流感病毒对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。常用消毒剂容易将其灭活，如氧化剂、稀酸、十二烷基硫酸钠、卤素化合物（如漂白将其灭活，如氧化剂、稀酸、十二烷基硫酸钠、卤素化合物（如漂白粉和碘剂）等都能迅速破坏其传染性。粉和碘剂）等都能迅速破坏其传染性。n 禽流感病毒对热比较敏感，禽流感病毒对热比较敏感，6565加热加热30min30min或煮沸（或煮沸（100100 ）2min2min以以上可灭活。病毒在粪便中可存活上可灭活。病毒在粪便中可存活1 1周，在水中可存活周，在水中可存活1 1个月，在个月，在pHpH4.14.1的条件下也具有存活能力。病毒对低抗温抵力较强，在有甘油保的条件下也具有存

13、活能力。病毒对低抗温抵力较强，在有甘油保护的情况下可保持活力护的情况下可保持活力1 1年以上。年以上。n 病毒在直射阳光下病毒在直射阳光下404048h48h即可灭活，如果用紫外线直接照射，可迅即可灭活，如果用紫外线直接照射，可迅速破坏其传染性。速破坏其传染性。抵抗力抵抗力动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验二、检验二、检验病毒的鉴定血清学试验结果报告病原的分离动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验1.1.病原的分离病原的分离n 病毒分离：病毒分离：AIAI的诊断通常是要靠病原的分离及病毒血清型和亚型的鉴

14、的诊断通常是要靠病原的分离及病毒血清型和亚型的鉴定。通常情况下，禽类只感染定。通常情况下，禽类只感染A A型流感病毒。型流感病毒。病料采集：病料采集：病毒常在呼吸道和病毒常在呼吸道和/ /或消化道中复制增殖，所以采集病料或消化道中复制增殖，所以采集病料多从气管或泄殖腔中采集。多从气管或泄殖腔中采集。方法：方法：以棉花或其它材料制成的拭子采集病料样品，放入加抗生素的以棉花或其它材料制成的拭子采集病料样品，放入加抗生素的无菌培养液中。无菌培养液中。保存：保存：最好低温（最好低温（44）或）或-70-70保存，以液态氮或干冰较好。病料样保存，以液态氮或干冰较好。病料样品在保存或运送前可先行处理，制成

15、品在保存或运送前可先行处理，制成10%10%的悬液，并进行低速离心澄的悬液，并进行低速离心澄清。清。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 病毒的培养：病毒的培养：通常用于病毒分离的材料是鸡胚（通常用于病毒分离的材料是鸡胚（应该用应该用SPFSPF鸡胚），鸡胚细胞培养物鸡胚），鸡胚细胞培养物也可供病毒增殖。取也可供病毒增殖。取0.1mL0.1mL处理好的处理好的病料，以尿囊腔途径接种病料，以尿囊腔途径接种9 91111日龄日龄的鸡胚，可同时羊膜腔接种以增加的鸡胚，可同时羊膜腔接种以增加病毒增殖的可能性。病毒增殖的可能性。一般来说，如果样品中有病毒存

16、在一般来说，如果样品中有病毒存在，初次传代后就足以产生红细胞凝，初次传代后就足以产生红细胞凝集作用。如果未检测到血凝活性，集作用。如果未检测到血凝活性，需将收获的鸡胚囊液再传一代。需将收获的鸡胚囊液再传一代。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 在病毒的分离和鉴定的同时，常在病毒的分离和鉴定的同时，常常要做病原的致病性试验，以确常要做病原的致病性试验，以确定所分离毒株是强毒株还是非致定所分离毒株是强毒株还是非致病株或低致病株。尽管体外试验病株或低致病株。尽管体外试验可以获得一些有关致病力的数据可以获得一些有关致病力的数据。但用动物作攻毒试验来确定

17、病。但用动物作攻毒试验来确定病毒的性质特性是必要的，这也是毒的性质特性是必要的，这也是推荐的标准。推荐的标准。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 用于病毒鉴定的标准方法是以鸡红细胞检测胚液的血凝活性，用于病毒鉴定的标准方法是以鸡红细胞检测胚液的血凝活性，常量法和微量法都可使用。常量法和微量法都可使用。n 确定尿囊液或其它胚液的血凝活性后，还要鉴别是否由副粘病确定尿囊液或其它胚液的血凝活性后，还要鉴别是否由副粘病毒鸡新城疫病毒（毒鸡新城疫病毒（NDVNDV）所致。因此，首先要用）所致。因此，首先要用NDND抗血清作抗血清作HIHI试验，以排除试验

18、，以排除NDVNDV的可能性。如果的可能性。如果NDV HINDV HI阴性，才可以进行下阴性，才可以进行下一步工作，即确定一步工作，即确定A A型流感病毒型流感病毒NPNP抗原的存在。可用血清学方抗原的存在。可用血清学方法，如双向扩散、免疫电泳或单辐射溶血试验等方式来检测型法，如双向扩散、免疫电泳或单辐射溶血试验等方式来检测型特异性的核心抗原特异性的核心抗原NPNP或或MPMP。A A型流感病毒都具有相同的型特异型流感病毒都具有相同的型特异性抗原。性抗原。2.2.病原的鉴定病原的鉴定动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验血凝试验与血凝抑制试验琼脂凝

19、胶扩散试验3.3.生物学试验生物学试验动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验血凝试验原理血凝试验原理n 有些病毒的表面有血凝素，有些病毒的表面有血凝素，能与某些动物的红细胞表面能与某些动物的红细胞表面受体结合，从而出现红细胞受体结合，从而出现红细胞凝集现象，称为病毒的血凝凝集现象，称为病毒的血凝现象，简称病毒的血凝。现象，简称病毒的血凝。病毒病毒红细胞红细胞动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验血凝抑制试验原理血凝抑制试验原理

20、n 当病毒与相应的抗病毒抗当病毒与相应的抗病毒抗体结合后，能使红细胞的体结合后，能使红细胞的凝集现象受到抑制，为病凝集现象受到抑制，为病毒血凝抑制现象，简称病毒血凝抑制现象，简称病毒的血凝抑制。毒的血凝抑制。有其受体的红有其受体的红细胞细胞 v血凝性血凝性病毒病毒 特异性抗体特异性抗体 非特异性抗体非特异性抗体 动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验vvvvvvvvvvvv当当病病毒毒遇遇到到特特异异性性抗抗体体时时当当病病毒毒遇遇到到非非特特异异性性抗抗体体时时动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验琼脂扩

21、散试验琼脂扩散试验n 抗原制备：抗原制备：抗原可用标准株或已知毒株自行制备。一般都采集有抗原可用标准株或已知毒株自行制备。一般都采集有血凝活性的鸡胚绒毛尿囊膜（血凝活性的鸡胚绒毛尿囊膜（CAMCAM），用），用pH7.2pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗磷酸盐缓冲液冲洗CAMCAM后，吸干，磨碎，冻融后，吸干，磨碎，冻融3 3次或超声波处理，再低速离心，取上次或超声波处理，再低速离心，取上清液加入甲醛（至终浓度清液加入甲醛（至终浓度0.1%0.1%），），3737灭活灭活3636小时，即可应用。小时，即可应用。n 琼脂板制备琼脂板制备 n 加样：加样：中心孔加待检抗原，周围孔加入各型标准阳性血清，各孔

22、中心孔加待检抗原，周围孔加入各型标准阳性血清，各孔加满止。将琼脂板放湿盒中，加盖后放在室温或加满止。将琼脂板放湿盒中，加盖后放在室温或3737温箱中自然温箱中自然扩散。扩散。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验n 观察与结果判定：观察与结果判定：扩散扩散2424小小时后，可将平皿放于暗视野时后，可将平皿放于暗视野箱上或借自然光进行观察，箱上或借自然光进行观察，5 57 7天最后判定。当被检抗原天最后判定。当被检抗原与某一标准血清一致时，在与某一标准血清一致时，在抗原与相应血清之间出现灰抗原与相应血清之间出现灰白色的沉淀线，此时根据标白色的沉淀线，此

23、时根据标准血清型别，便可确定被检准血清型别，便可确定被检抗原中口蹄疫病毒的型别。抗原中口蹄疫病毒的型别。白色沉淀线白色沉淀线动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验4.4.报告结果报告结果n 综合以上试验结果，报告检样单位中检出或未检出禽流感病综合以上试验结果，报告检样单位中检出或未检出禽流感病毒。毒。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验三、卫生评价与处理三、卫生评价与处理n 发生高致病性禽流感时，要根据发生高致病性禽流感时，要根据高致病性禽流感防治技高致病性禽流感防治技术规范术规范要求和相关法律法规严格执行封锁、隔离、消毒要求和相关法律法规严格执行封锁、隔离、消毒和焚毁病鸡群及尸体等综合性防制措施。及时确诊，鉴定和焚毁病鸡群及尸体等综合性防制措施。及时确诊，鉴定病毒的毒力和致病性。确诊后立即封锁和隔离疫区，并上病毒的毒力和致病性。确诊后立即封锁和隔离疫区，并上报有关部门。报有关部门。动物检疫检验技术专业教学资源库动物性食品中禽流感病毒检验动物性食品中禽流感病毒检验三、卫生评价与处理三、卫生评价与处理n 划定疫区，严格封锁，对划入控制区的禽场密切监视，清除和扑杀所划定疫区，严格封锁，对划入控制区的禽场密切监视，清除和扑杀所有感染高致病性禽流感的禽、禽产品、废物杂物、粪便、饲料和设备有感染高