工科分析化学毛细管电泳随堂讲义.

1、分析化学分析化学第第章章 毛细管电泳法毛细管电泳法Capillary Electrophoresis, CE 毛细管电泳是带电毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱粒子在电场力的驱动下，在毛细管中动下，在毛细管中按其淌度或和分配按其淌度或和分配系数不同进行高效系数不同进行高效、快速分离的电泳、快速分离的电泳新技术，也称为高新技术，也称为高效毛细管电泳效毛细管电泳。 20世纪世纪3040年代年代 蒂塞蒂塞利乌斯利乌斯 (A.W.K.Tiselius）建立了建立了移动界面电泳移动界面电泳，将电泳发展成分将电泳发展成分离技术离技术 获得获得1948年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖n 1981年年 J.W.Jo

2、rgenson, ,K.D.Lukacs实验上和实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。析方法。 第第22章章 毛细管电泳法毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis, CE) 1 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理 2 分离模式分离模式 3 进样与检测进样与检测 4 毛细管电泳的应用毛细管电泳的应用第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理1 装置装置 毛细管毛细管 数据处理数据处理 电极电极

3、检测器检测器 电极电极 试样试样 缓冲液缓冲液 缓冲液缓冲液 高压电源高压电源 （可高至（可高至3030KVKV） 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电泳是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。移动的现象。 电渗电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。液体沿固体表面移动的现象。 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电泳电泳行为与特性使

4、用淌度描述行为与特性使用淌度描述 即单位场强即单位场强( (E E) )下离下离子的平均电泳速度子的平均电泳速度 ep=/E实验中，只发生电泳时有效淌度实验中，只发生电泳时有效淌度 ef =ef (L /V) =( l / tm )(L /V) 毛细管有效长度毛细管有效长度 迁移时间迁移时间 毛细管总长度毛细管总长度 电压电压 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗电渗与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁

5、的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow ,EOF）。）。 固液两相间的总固液两相间的总电势电势-热力学电势热力学电势-0 Zeta电势电势- 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的流型特点电渗流的流型特点电渗流电渗流 HPLCHPLC塞流

6、塞流 层流层流 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的表示电渗流的表示电渗流的大小可用淌度电渗流的大小可用淌度(eo)或电渗流系数表示或电渗流系数表示 eo =eo / E = l /( teoE )电渗流速度电渗流速度 毛细管有效长度毛细管有效长度 电渗流流出时间电渗流流出时间 电场强度电场强度 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 电渗流的意义电渗流的意义1.1. 电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象2.2. 电渗流的速度比电泳速度快电渗流

7、的速度比电泳速度快5 57 7倍倍3.3. 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。泳分离的效率、重现性、分离度。 分情况而论分情况而论第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 改变电渗流的方法

8、改变电渗流的方法1.1.改变外加径向电场改变外加径向电场2.2.改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度 ZetaZeta电势电势3.3.改变缓冲液改变缓冲液pHpH4.4.加入添加剂加入添加剂5.5.改变温度改变温度 粘度粘度 盐盐-离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂eo正比于正比于Zeta电势和介质的电势和介质的介介电常数电常数 反比于反比于介质的黏度介质的黏度Zeta电势正比于电势正比于双电层厚度双电层厚度和和界界面有效电荷密度面有效电荷密度 反比于介质的反比于介质的介电常数介电常数表观电泳淌度表观电泳淌度 apap=ap/E ap为离子的表观迁移速度为离子的表观迁移速度 ap=ef

9、+eo ap= ef + eo第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理2 电泳和电渗电泳和电渗 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离效率分离效率柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数n表示表示 n = (ep+eo) V l /(2DL) 毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程 理论塔板高理论塔板高 H =L / n n = 5.54(/ W)2 实验上可按上式求出理论塔板数实验上可按上式求出理论塔板数 为电泳图上从为电泳图上从起点起点至电泳至电泳峰最大值峰最大值之

10、间的距离之间的距离 W W为电泳峰的为电泳峰的半高峰宽半高峰宽 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理3 分离效率和分离度分离效率和分离度 分离度分离度电泳中两峰的分离度（电泳中两峰的分离度（Rs），），也称为分辨率，它也称为分辨率，它表示了淌度相近的组表示了淌度相近的组分分分开的能力，可表达为分开的能力，可表达为 Rs= （n 1/2/4）（）（ /平平 ）相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差平平为两者的平均速度为两者的平均速度 / / 平平表示分离选择性表示分离选择性n n为柱效为柱效分离度计算式分离度计算式Rs = 2 (tm2 - tm1

11、) / ( W1 + W2 )tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间W 为为峰底的宽度峰底的宽度 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理3 分离效率和分离度分离效率和分离度 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 区带宽度区带宽度 Ws =（Wtl/tm）-Wd 时间宽度时间宽度检测器的窗口宽度检测器的窗口宽度空间宽度空间宽度第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 区带

12、宽度区带宽度展宽因素展宽因素 1. 焦耳热焦耳热 2. 进样进样3. 电泳扩散电泳扩散4.毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 焦耳热焦耳热 细内径（细内径（100100mm），），粗外径的毛细管柱粗外径的毛细管柱 温度轮廓温度轮廓 - 黏度轮廓黏度轮廓 -速度轮廓速度轮廓第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 进样进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区

13、带控制在柱长的1% 电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。而引起区带电分散。 s-b 峰前展或拖尾？峰前展或拖尾？第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：抑制吸附作用常用的方法有： 使用极端使用极端pHpH条

14、件条件 加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物 对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流需要注意：方法也会抑制或改变电渗流 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 221 毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理4 区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式 1 1 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 2 2 胶束电动色谱胶束电动色谱 3 3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 4 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 5 5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 6 6 毛细管电色谱毛细管电色谱第二十二章第二十

15、二章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式1 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 CZE CZE 也称为毛细管自由溶液区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体它各种操作模式的母体 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式2 胶束电动色谱胶束电动色谱 电动色谱电动色谱: :是以电渗流驱动的一种色谱技术是以电渗流驱动的一种色谱技术胶束电动色谱胶束电动色谱 MEKC: MEKC:是以胶束为假固定相的一种电动色是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合

16、谱，是电泳技术和色谱技术的结合加入高于胶束临界浓度的加入高于胶束临界浓度的表面活性剂表面活性剂胶束电动色谱的应用特点胶束电动色谱的应用特点: : 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物中性化合物. . 比高效液相色谱更为高效比高效液相色谱更为高效. . HPLC HPLC 分离柱效为分离柱效为500050002500025000理论板数理论板数/ /m m MEKC MEKC 可达到可达到5000050000500000500000理论板数理论板数/ /m m 比高效液相色谱更为高速比高效液相色谱更为高速. .MEKCMEKC分离

17、时间通常小于分离时间通常小于3030minmin，但达到相仿效率的毛细管但达到相仿效率的毛细管LCLC，需要更长的时需要更长的时间。间。 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式2 胶束电动色谱胶束电动色谱第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳CGECGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式式 用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离按分子的大小分离 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳

18、的综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点优点 : :1.1. 电泳峰尖锐，柱效极高电泳峰尖锐，柱效极高2.2. 短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离3.3. 试样容量为试样容量为10101212g g主要缺点主要缺点:制备柱较困难，寿命较短制备柱较困难，寿命较短已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核 酸、酸、DNADNA等强有力的工具。例应用等强有力的工具。例应用CGECGE分离与分离与激光诱导荧光检测相结合，用于激光诱导荧光检测相结合，用于DNADNA序列快速序列快速分析。分析。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式3 毛细

19、管凝胶电泳毛细管凝胶电泳第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳分离是建立在试样中各组分的电分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同，等速电泳中被分泳淌度不同，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用析试样进样前后分别使用前导前导电解质溶液电解质溶液和和终结电解质溶液终结电解质溶液，分离后的各组分区带以相同，分离后的各组分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口的电泳迁移速度通过检测窗口。 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳注意注意:1. 前导电解质的电泳淌度应高于试样前导电解质的电泳淌度应

20、高于试样中各组分的电泳淌度，而终结电解中各组分的电泳淌度，而终结电解质的电泳淌度则反之。质的电泳淌度则反之。2. 电泳过程中被分离各组分的浓度都电泳过程中被分离各组分的浓度都将接近前导电解质浓度，对痕量组将接近前导电解质浓度，对痕量组分在柱上浓缩可达几个数量级，成分在柱上浓缩可达几个数量级，成为重要的柱上为重要的柱上浓缩技术浓缩技术之一。之一。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦CIEFCIEF: : 建立在不同蛋白质或多肽之间等建立在不同蛋白质

21、或多肽之间等电点（电点（pIpI值）差异基础上的分离方值）差异基础上的分离方法。法。蛋白质的等电点蛋白质的等电点( (pI)pI): : 指蛋白质分子的表观电荷数为零指蛋白质分子的表观电荷数为零时的时的pHpH值。值。 方法方法: 进样等电聚焦检测进样等电聚焦检测1.1. 先将脱盐的试样（蛋白质）以先将脱盐的试样（蛋白质）以11的浓度与两性电的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱( (阳极端阳极端) )，置于阳极电解质溶液如置于阳极电解质溶液如H H3 3POPO4 4中，检测端为阴极端，置中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如于阴极电解质如NaO

22、HNaOH中。中。2.2. 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pHpH的的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pHpH区域区域内停止移动。这样内停止移动。这样pIpI不同的蛋白质各组分会在毛细管不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同内很窄的不同pHpH区域内聚焦区域内聚焦. . 3.3. 在阳、阴极电解液中加入盐如在阳、阴极电解液中加入盐如NaCINaCI或或NaOH,NaOH,破坏破坏pHpH梯梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测

23、，使不同组分的蛋白质得到分离。迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦特点特点: :1.1.等电聚焦实际上也是一个试样浓缩等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组过程，这一过程可用于浓缩试样组分分。2.2.具有极高的分辩率，可以分离等电具有极高的分辩率，可以分离等电点相差点相差0.010.01pHpH的两种蛋白质的两种蛋白质. .注意注意: :电渗流的存在会破坏聚焦区带的电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定稳定 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式5 毛细管等电聚

24、焦毛细管等电聚焦第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 222 分离模式分离模式6 毛细管电色谱毛细管电色谱CEC:CEC:以电渗流驱动流动相，以电渗流驱动流动相， 开管和填充两种开管和填充两种比高效液相色谱具有更高的柱效比高效液相色谱具有更高的柱效 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 223 进样与检测进样与检测1 1 进样方法进样方法电动进样电动进样 也称电迁移进样也称电迁移进样. . 方法方法: :将毛细管的进样端插入装有试样溶液的将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在试样溶液在电泳和电渗电泳和电渗流作用下进入毛细管流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。即可进行。 第第22章章 毛细管电泳毛细管电泳 223 进样与检测进样与检测 1 进样方法进样方法 流体动力学进样流体动力学进样 也称为虹吸进样、重力进样、压差进样也称为虹吸进样、重力进样、压差进样方法方法: :毛细管进样端插入试样溶液容器，通过毛细管进样端插入试样溶液容器，通过进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端加压，或检测端出口减压，或调节进样端试样溶液液面大于出口端缓冲液液