细胞和动物组织核蛋白的提取方法

1、细胞和动物组织核蛋白的提取方法产品组成310001 310002规格 50 assays 100 assaysBuffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20mlBuffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物250ul 500ul使用方法：A细胞蛋白提取1 .取5-10 X 106个细胞，在4C, 500Xg条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。2 .用冷PBSa涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。3 .每20ul细胞压积中加入200“ 冷的Buffer

2、A , 2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。4 .再次高速涡旋振荡5秒，然后在4C, 16000X g条件下离心5分 钟。5 . 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80 冰箱保存备用。6 .在沉淀中加入200 6冷的Buffer B , 2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15 秒。7 . 置冰上 40 分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15 秒。8 .在4C, 16000X g条件下离心10分钟。9 . 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。8 组织蛋白提取1 .取适量组织样本剪碎，加冷 PBS用组织匀浆器匀浆至无明显肉

3、眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5 分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。2 .在4C, 500Xg条件下离心2-3分钟，弃上清。3 . 按照细胞蛋白的提取方法的第3 步骤往下操作即可。上述蛋白提取物请分装后于-80 冰箱保存备用。注意事项：1. 实验过程中的所有BestBio- 贝博生物试剂须预冷；所有器具须放-20 冰箱预冷。2. 整个过程须保持样品处于低温状态。储存条件：-20 保存。有效期：一年。DXY 网友 qingraner 问： 本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展， 我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分

4、感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-a （标细胞质）和Oct-1 （标细胞核），似乎抗体也不是很好用。我做的是BT474 细胞，breast cancer cell。我的方法如下：1 、用 Buffer A 洗涤2 、 500G 离心 5 分钟3、用 BufferA+B （ 2： 1 ）裂解细胞，轻轻混匀，孵育5-10 分钟4、 12000G 离心 10 分钟（上清：细胞质。沉淀：细胞核和细胞膜）5、 PBD 洗涤细胞两次，12000 G 离心 10 分钟6、 Buffer C 裂解细胞膜（放入液氮中快速冷冻，在冰上融化10 分钟）7、 12000G 离心10 分钟（上清：细胞核。沉淀：细胞膜

5、）8、 用PBS 洗涤9、 用PRPABuffer 在冰上放置30分钟10、 、 12000 G 离心 10 分钟（上清：细胞膜）BufferA： 10 mmol/L Hepes 7.5； 10 mmol/L kcl； 1.5 mmol/L Mgcl2； 0. 5 mmol/LDTT ； 1 mmol/LNaF ； 1 mmol/L glycerol phosphate ； 1 prptease i nhibitor cocktail tablet/50mlBufferB ： BufferA+0.15% of Nonidet P-40；BufferC ： 20 mmol/L Hepes 7.5

6、； 420 mmol/L Nacl ； 1.5 mmol/L Mgcl2； 0.5 mmol/LDTT ； 1 mmol/LNaF ； 1 mmol/L glycerol phosphate ； 1 prpte ase inhibitor cocktail tablet/50mlDXY 网友 kevinfong 回复： 你是不是分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，然后做Western发现细胞核中也有Ikb-a,或者细胞浆中也能检测到 Oct-1啊？如果是或者，我觉得挺正常的，因为转录因子部分也存在于细胞浆，至于 Ikb-a是不是细胞质特异性的我就不清楚了。但是， 我觉得你用的是试剂盒应该没有问题的，然

7、而也很难彻底分开，在步骤 4 吸取上清时小心点，不要触及沉淀，可以剩少许上清（这部分上清不收集），然后用白尖再把这些上清吸干净扔掉，这样可以尽量减少各个组分的污染。我用过试剂盒分过细胞浆和细胞核蛋白，感觉还行，至少不影响实验结果。如果，你想精确的彻底的分离，或者想得到Oct-1 的话，建议你采用蔗糖梯度离心方法再次富集你收集的各个组分上清，这可以分离得到比较纯的你想要检测的那些蛋白组分。楼主问： 感谢指点，我有如下几个问题，多谢回答1 、在实验过程中，我收集上清的时候的确是收集一部分，但是剩下的没有弃下，下次改进。2、对于我的抗体。Ikb-a是多克隆抗体，非特异性很强，感觉十分难做；OCT-1

8、 虽然是单抗，但我基本上没有检测它应该的大小（90K 左右），只是检测到其它的分子量，不清楚为什么，大概40 多 K 吧！3、我想请问您用试剂盒的效果不影响实验是什么意思？那哪个牌子的试剂 盒好用，还有，您检测的方法跟我的抗体一样吗？4、我的配方里面一直是加好了DTT 的，不现加现用有什么后果吗？DXY 网友 kevinfong 回复： 首先我做的抗体跟你不一样，但我可以回答你的问题：2 .我用的大部分抗体多是多克隆抗体，也会有其他非特异性带，但是不论怎么目的带总是最明显的，基本上不会影响结果，而且我也发现不同的来源的细胞用同一种抗体，有的就不会用其他非特异性带，有的不管怎么都会有非特性带，有

9、几个方法可以尽量消除非特性带，抗体的量少加一点，我抗体基本上都是1 ：1000 以上， 孵育过夜，二抗的量1 ： 20000（北京中杉）， 再则可以减少上样量，我一般 50-75ug 左右，这些前提抗体必须效价高。我在抗体上吃过很大的亏，买了两家公司的抗体，都是进口有名的，都没杂出来，后来用了第三家的，就很顺利的做出来了。所以抗体很重要。所以，你首先得排除抗体的问题。我没做过Ikb- a和OCT-1 ,所以不敢断定你用的 OCT抗体有问题，不顾第一次做，一般抗体量加多一定，先保证抗体能杂出来，接下来再做改善。3 .我指的是我用的试剂盒分离细胞浆细胞核组分，那它们去做我的实验包括Western 和